Kiểm tra công thức khử trùng: cấy mẫu đối chứng bằng cách quệt hoặc lăn mẫu đã khử trùng lên trên bề mặt thạch sao cho bề mặt các mẫu cây đƣợc tiếp xúc với bề thạch nhiều nhất (mẫu đối chứng) .
Mẫu khử trùng đã đƣợc cấy mẫu đối chứng tiến hành cắt tại các vị trị đã đặt tiếp xúc với bề mặt thạch và cấy lên bề mặt thạch sao cho vị trí cắt đƣợc tiếp xúc với bề mặt thạch nhiều nhất (mẫu thí nghiệm – mẫu phân lập). • Củ: cắt lát mỏng, lấy các mẫu chứa cả vỏ.
• Rễ: cắt thành đoạn dài 1 cm. • Thân: cắt lát mỏng ngang thân.
• Lá: cắt thành miếng với kích thƣớc khoảng 1x1 cm
Hình 3.5: Mẫu thí nghiệm (mẫu lá, c nuôi cấy phân lập nấm nội sinh)
Các mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm đƣợc bọc kín bằng paraffin. Tiến hành nuôi mẫu trong điều kiện 24 OC. Sau 48h có thể kiểm tra mẫu : mẫu đối chứng không có gì (vi sinh vật không xuất hiện trên môi trƣờng nuôi cấy) chứng tỏ khử trùng mẫu đã sạch; mẫu đối chứng có dấu hiệu nấm phát triển chứng tỏ khử trùng mẫu chƣa sạch hoặc sinh vật của mẫu tại những điểm bị tổn thƣơng, cần tiến hành lại thí nghiệm với loại mẫu này.
Sau 2-3 ngày nuôi cấy sợi nấm bắt đầu phát triển trên bề mặt thạch, khi xuất hiện các sợi nấm mọc trên đĩa thạch cần tiến hành cấy chuyển luôn, tránh hiện tƣợng mọc lẫn nhau của 2 hay nhiều chủng nấm. Sử dụng que cấy đầu tròn gạt nhẹ qua các sợi nấm và cấy sang đĩa thạch mới theo hình cửa xếp.
Theo dõi sự phát triển của nấm và các mẫu đối chứng, mẫu thí nghiệm trong 2-3 tuần. Đồng thời cấy chuyển nhiều lần đến khi chủng nấm đƣợc sạch, tiến hành phân loại của chủng nấm rồi mới tiến hành sinh khối lƣợng lớn.
Kết quả thu đƣợc 17 chủng nấm nội sinh khác nhau dựa vào nguồn gốc và hình thái bằng mắt thƣờng trong quá trình nuôi cấy. Các mẫu nấm nội sinh đƣợc kí hiệu theo tên chữ cái.
+ Ch ng nấm A:
Nguồn gốc phân lập: củ và rễ nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm dầy, sợi khí sinh phát triển kém. Ban đầu sợi nấm màu trắng, khi già sợi nấm màu trắng vàng rồi ngả sang mầu hồng trắng. Có nhiều vòng tròn đồng tâm, dạng hạt.
Hình 3.6: Ch ng nấm A + Ch ng nấm B1:
Nguồn gốc phân lập: củ cây nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm phát triển mạnh và ăn đều từ tâm ra xung quanh. Sợi khí sinh phát triển tốt. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu tím đỏ.
+ Ch ng nấm B2:
Nguồn gốc phân lập: củ cây nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm phát triển khá tốt, sợi khí sinh phát triển có màu trắng. Nhìn phía dƣới bề mặt thạch sợi nấm kị khí có màu vàng trắng.
Hình 3.8: Ch ng nấm B2 + Ch ng nấm C:
Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ. Đặng điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, có màu trắng. Bào tử có màu vàng, khi già chuyển sang mà xanh.
Hình 3.9: Ch ng nấm C + Ch ng nấm D:
Nguồn gốc phân lập: lá cây nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển và hình thành các đám bông. Sợi kị khí có sự phân nhánh nhƣ rễ cây. Sợi nấm có màu xám trắng.
+ Ch ng nấm E:
Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, mọc phân tán đều từ tâm ra xung quanh. Sợi kỵ khí có màu đen, có hình các vòng tròn đồng tâm khi nhìn úp đĩa thạch.
Hình 3.11: Ch ng nấm E + Ch ng nấm F:
Nguồn gốc phân lập: lá cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, bông, có màu trắng.
Hình 3.12: Ch ng nấm F + Ch ng nấm G:
Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, có màu trắng, khi già có mầu nâu trắng.
+ Ch ng nấm H:
Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, ban đầu màu xám trắng sau đó chuyển màu nâu.
Hình 3.14: Ch ng nấm H + Ch ng nấm I:
Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm phát triển chậm, sợi khí sinh có màu trắng, sợi kỵ khí phát triển chia nhánh giống hình cây thông có màu nâu đỏ.
Hình 3.15: Ch ng nấm I + Ch ng nấm J:
Nguồn gốc phân lập: thân cây nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh kém phát triển, có bào tử màu xanh da trời.
+ Ch ng nấm K:
Nguồn gốc phân lập: thân cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh kém phát triển, bào tử có màu xanh vàng xếp thành nhiều vòng tròn đồng tâm, xếp gần nhau.
Hình 3.17: Ch ng nấm K
+ Ch ng nấm L:
Nguồn gốc phân lập: thân cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh bông và dầy. Sợi nấm màu trắng tuyết, có dấu hiệu tiết dịch hoặc đọng nƣớc hình cầu không màu.
Hình 3.18: Ch ng nấm L + Ch ng nấm M:
Nguồn gốc phân lập: thân cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm phát triển chậm, ban đầu có màu trắng rồi chuyển màu vàng xanh. Mặt dƣới nhìn sợi kỵ khí có màu cam.
+ Ch ng nấm Ng1:
Nguồn gốc phân lập: củ nghệ
Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm khí sinh phát triển và có màu trắng. Có sinh bào tử.
Hình 3.20: Ch ng nấm Ng1
+ Ch ng nấm Ng2:
Nguồn gốc phân lập: củ nghệ
Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm kị khí phát triển mạnh màu trắng sữa. Sinh bào tử màu vàng.
Hình 3.21: Ch ng nấm Ng2
+ Ch ng nấm Ng3:
Nguồn gốc phân lập: củ nghệ
Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm kị khí phát triển khá mạnh. Không nhìn rõ bào tử.