Sau khi nuôi cấy sinh khối nấm trong 35 ngày, các sợi nấm đã phát triển kín môi trƣờng gạo sẽ tiến hành diệt nấm bằng tia UV trong box cấy. Nấm sinh khối đƣợc ngâm chiết trong dung môi Ethylacetate đồng thời tiến hành đánh khuấy bằng máy khuấy để phá vỡ các môi trƣờng sinh khối và sợi nấm tăng hiệu suất chiết. Sau khoảng 12h tiến hành chắt lọc dung môi ngâm chiết bằng giấy lọc thu dịch chiết nấm. Quá trình ngâm chiết đƣợc làm 5 lần và cô quay thu đƣợc cặn chiết EtOAc (Ethyl acetate). Cặn chiết EtOAc đƣợc chiết phân lớp với tỷ lệ dung môi MeOH / n-Hexan là 90 / 10 trong phễu chiết. Lắc đều trong khoảng 1h rồi để phân lớp tự nhiên, sau đó mới chắt phần n-Hexan riêng. Phần MeOH tiếp tục đƣợc hòa với n-Hexan với tỷ lệ nhƣ trên và chiết khoảng 3-4 lần thu đƣợc 2 loại: dịch chiết MeOH và dịch chiết n- Hexan. Quy trình ngâm chiết nấm đƣợc mô tả trong sơ đồ 3.1.
Sơ đồ 3.1: Qui trình ngâm chiết mẫu nấm đã sinh khối
Hình 3.28: Ngâm chiết mẫu sinh khối ch ng nấm
Kết quả thu đƣợc khối lƣợng mẫu dịch chiết nhƣ sau: Cặn H2O: 7g
Cặn MeOH: 20g Cặn n-Hexan: 4.5g
3.2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng nấm B.cinera c a các dịch chiết tổng
Các cặn chiết đƣợc tiến hành thử hoạt tính ức chế nấm Botrytis cinera ở nồng độ 1500 ppm dịch chiết tổng. Mỗi mẫu dịch chiết đƣợc cân 45 mg dịch chiết vào ống Eppendorf pha trong 1.5 ml dung môi của từng loại cặn chiết, sau đó tiến hành siêu âm trong 10 phút cho tan hoàn toàn. Nhƣ vậy, các dịch chiết này đƣợc pha vào trong 30 ml ta đƣợc nồng độ dịch chiết trong môi trƣờng thạch là 1500 ppm. Môi trƣờng chứa dịch chiết này đƣợc đổ đều ra 3 đĩa thạch. Hoạt lực ức chế nấm của các dịch chiết nấm đối với sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera đƣợc đánh giá theo công thức sau:
KNƢC % = (C – T) / C x 100 Trong đó:
KNƢC %: Khả năng ức chế của dịch chiết với nấm T: Đƣờng kính tản nấm ở công thức thí nghiệm C: Đƣờng kính tản nấm ở công thức đối chứng âm
Kết quả thử hoạt tính của các cặn chiết đƣợc mô tả trong bảng 3.1:
TT Mẫu Đĩa 1 TB Đĩa 2 TB Đĩa 3 TB Trung bình (mm) Hoạt tính % ĐK1 ĐK2 ĐK1 ĐK2 ĐK1 ĐK2 1 ĐC 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80.00 0.00 2 NB1W 59 59 59 59 59 59 60 60 60 59.33 25.83 3 NB1H 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80.00 0.00 4 NB1M 35 35 35 34 34 34 35 36 35.5 34.83 56.46
Bảng 3.1: Hoạt tính ức chế nấm Botrytis cinera c a các dịch chiết nấm
Nhƣ vậy có thể thấy cặn chiết MeOH từ chủng nấm Fusarium sp. (B1) có khả năng ức chế sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera gay bệnh thối xám trên rau quả là tƣơng đối cao (56.46%). Cặn chiết nƣớc của chủng nấm này cũng có hoạt tính nhƣng vẫn còn tƣơng đối thấp (25,83 %). Cặn chiết n- Hexan của chúng nấm này không có hoạt tính ức chế sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera. Nhƣ vậy, chủng nấm Fusarium sp. (B1) chứa các chất có
hoạt tính ức chế sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera trong cặn chiết MeOH, các chất hòa tan trong dung môi n-Hexan không có hoạt tính ức chế sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera.
Hình 3.29: Hình ảnh thử hoạt tính ức chế sự phát triển ch ng nấm
Botrytis cinera c a các cặn chiết. 3.2.3. Kết quả phân lập chất từ nấm Fusarium sp. (B1).
Cặn chiết MeOH đƣợc phân tách trên cột hấp phụ silica gel với hệ dung môi n-Hexan:Aceton (từ 1:0 đến 0:1) thu đƣợc 11 phân đoạn. Phân đoạn số 4 chứa nhiều dầu nên đƣợc chạy GC-MS và thu đƣợc công thức hóa học của 12 loại acid ký hiệu các chất 1-12. Phân đoạn số 6 tiếp tục đƣợc phân tách trên cột silica gel với hệ dung môi n-Hexan:ethyl acetate (từ 1:0 đến 0:1) thu đƣợc chất 13. Phân đoạn số 8 đƣợc rửa bằng Aceton thu đƣợc tinh thể dạng bột tan trong MeOH nóng thu chất 14. Quy trình tách chiết các chất 1-14 đƣợc mô tả trong sơ đồ 3.2.
Sơ đồ 3.2: Qui trình phân lập các hợp chất từ nấm Fusarium sp. (B1) NB1M 20g NB1M 1 0.14g NB1M 10 0.39g NB1M 11 0,13g NB1M 4 2,68g NB1M 3 1.02g NB1M 2 0,55g NB1M 9 2.92g NB1M 5 6,01 g NB1M 8 0.86g NB1M 6 0.82g NB1M 7 3,80g NB1M 6.1 0.30g NB1M 6.2 0.28g NB1M 6.4 NB1M 6.3 Chất 13 35mg Chất 14 Chất 1-12 CC silica gel n-Hexan:Aceton Diclometan:Methanol (GC/MS): ISO/FDIS 5590:1998, LB Đức Rửa tinh thể bằng Aceton. Tinh thể tan trong
MeOH nóng.
Rửa nhanh bằng Aceton thu đƣợc
tinh thể màu trắng, hình kim
Chất 1-12: Các chất 1-12 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp kỹ thuật sắc ký ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) tại Viện Hợp chất thiên nhiên. Thông tin các chất 1-12 đƣợc mô tả trong bảng 3.2:
TT Time Fatty acids Tên khoa học Hàm lƣợng %
1 10.39 14: 0 Tetradecanoic acid 0.93 2 13.57 15:0 Pentadecanoic acid 0.20 3 16.46 16:1n-7 9-Hexadecenoic acid 2.55 4 17.22 16: 0 Hexadecanoic acid 29.04 5 19.69 17: 0 Heptadecanoci acid 2.82 6 24.07 18: 2(n-6) Octadecadienoic acid 27.98 7 24.28 18:1(n-9) Octadecenoic acid 28.63 8 24.49 18:1(n-7) Octadecenoic acid 0.27 9 25.34 18: 0 Octadecanoic acid 6.9 10 33.75 20:0 Eicosanoic acid 0.34 11 41.92 22:0 Docosanoic acid 0.17 12 49.68 24:0 Tetracosanoic acid 0.17 Bảng 3.2: Thông tin các hợp chất 1-12 Chất 1: Tetradecanoic acid (Myristic acid)
Chất 2: Pentadecanoic acid (Pentadecylic acid)
Chất 3: 9-Hexadecenoic acid (Palmitoleic acid)
Chất 5: Heptadecanoci acid (Margaric acid)
Chất 6: Octadecadienoic acid (Linoleic acid)
Chất 7: Octadecenoic acid (Oleic acid)
Chất 8: Octadecenoic acid (Vaccenic acid)
Chất 9: Octadecanoic acid (Stearic acid)
Chất 10: Eicosanoic acid (Arachidic acid)
Chất 11: Docosanoic acid (Behenic)
Chất 13: β-sitosterol
Phân đoạn NB1M6.2 đƣợc rửa bằng n-Hexan và kết tinh lại thu đƣợc tinh thể hình kim màu trắng. Sau đó sử dụng sắc ký TLC với chất chuẩn β- sitosterolvà đã xác định đƣợc hợp chất phân lập đƣợc là β-sitosterol.
Chất có nhiệt độ nóng chảy là 132-133 OC, Rf = 0,26 trong hệ dung môi triển khai n-Hexan-axeton 9:1. Do đó kết luận đƣợc chất 13 là β-sitosterol
Chất 13: β-sitosterol
Chất 14: (24R)-Methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol
Chất 14 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng tan trong methanol nóng, nhiệt nóng chảy là 221-224oC, Rf = 0.61 trong hệ dung môi diclometan- methanol 9:1. Cấu trúc của chất 14 đƣợc xác định bằng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HSQC), kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo. Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của 6 nhóm methyl, bao gồm hai tín hiệu đơn (singlet) ở H = 0.91 (3H); 0.54 (3H) và bốn tín hiệu kép (doublet) ở H = 0.99 (J = 6.5 Hz, 3H);H = 0.88 (J = 7.0 Hz, 3H); H = 0.81 (J = 6.5, 3H) và H = 0.80 d (J = 6.5, 3H). Ngoài ra, sự có mặt của hai nối đôi thể hiện qua ba tín hiệu, gồm có hai proton ở vị trí trans của một nối đôi bị thế 2 lần ở H = 5.23 (dd, 1H, 7.5 & 15.5); 5.17 (dd, 1H, 8 & 15.5) và một proton của nối đôi bị thế ba lần ở H = 5.08 m (1H); tín hiệu của ba nhóm hydroxyl ở H = 4.48 d (5.5, 1H), 4.22 d (5.5, 1H) và 3.58 s (1H); tín hiệu của hai nhóm methin có gắn với nhóm hydroxyl ở H = 3.76 m (1H),
3.37 s (1H) và 20 aliphatic proton trong vùng từ 1.2 đến 2.0ppm cũng đƣợc quan sát thấy trong phổ 1H-NMR. Phổ 13C-NMR cho thấy phân tử chất 14 có 28 nguyên tử cacbon, hoàn toàn phù hợp với số liệu phổ 1H-NMR, bao gồm hai nối đôi ở C = 139.64 (C), 135.35 (CH), 131.36 (CH) và 119.41 (CH); ba cacbon có gắn với oxy ở C = 74.45 (C), 72.10 (CH), 65.94 (CH); 6 nhóm methyl ở C = 12.03, 17.25, 17.66, 19.42, 19.71, 20.94 và 15 cacbon cộng hƣởng trong vùng từ 21.30 đến 55.30 ppm. Công thức phân tử của chất 14 là C28H46O3 đƣợc rút ra từ các số liệu phổ 1
H, 13C-NMR và HSQC. Các dữ liệu phổ trên đây cho phép dự đoán chất 14 là một sterol dạng trihydroxyergostane. Cấu trúc của chất 14 đƣợc kết luận là (24R)- Methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol khi so sánh với tài liệu [18]. Chất này đã đƣợc phân lập trƣớc đây từ một loài san hô mềm Sinularia sp. Việc sắp xếp các số liệu phổ (bảng 3.3) là dựa vào việc phân tích các loại phổ, kết hợp so sánh tài liệu tham khảo.
Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR và HSQC c a chất 14 (DMSO, 500 và 125 MHz) 1H (DMSO) NB1M8.1 HSQC (DMSO) NB1M8.1 Chất 3 trong tài liệu [18] 13C (DMSO) NB1M8.1 1 1.6 m & 1.2 m 31.15/1.6 & 1.2 32.6 31.15 CH2 2 1.4 m & 1.3m, 1H 32.44/ 1.4 & 1.3 33.9 32.44 CH2 3 3.76 m, 1H 65.94/ 3.76 67.6 65.94 CH 4 1.9 m & 1.4 m 40.00/ 1.9 & 1.4 41.9 40.00 CH2 5 - 74.45 76.1 74.45 C 6 3.37 m, 1H 72.10/ 3.37 74.2 72.10 CH 7 5.08 m, 1H 119.41/ 5.08 120.4 119.41 CH 8 - 139.64 141.6 139.64 C 9 1.92m, 1H 42.24/ 1.92 43.8 42.24 CH 10 - 36.62 38.1 36.62 C 11 1.42 m 21.30/ 1.42 22.4 21.30 CH2 12 1.95 m & 1.23 m 39.0/ 1.95 & 1.23 39.9 39.0 CH2 13 - 42.96 43.8 42.96 C 14 1.80 m 54.14 / 1.80 55.3 54.14 CH 15 1.48 m & 1.3 m 22.56/ 1.48 & 1.3 23.5 22.56 CH2 16 1.7 m & 1.2 m 27.67/ 1.7 & 1.2 28.5 27.67 CH2 17 1.25 m 55.30/ 1.25 56.2 55.30 CH 18 0.91 s, 3H 17.66/ 0.91 18.8 17.66 CH3 19 0.54 s, 3H 12.03/0.54 12.5 12.03 CH3 20 0.99 d (6.5 , 3H) 20.94/0.99 21.5 20.94 CH3 21 2.0 m 39.95/ 2.0 40.8 39.95 CH 22 5.17 dd, 1H, 8 & 15.5 135.35/ 5.17 136.2 135.35 CH 23 5.23 dd, 1H 7.5 & 15.5 131.36/ 5.23 132.1 131.36 CH 24 1.82 m, 1H 41.98/ 1.82 43.1 41.98 CH 25 1.4 m, 1H 32.44/ 1.4 33.4 32.44 CH 26 0.80 d (6.5, 3H) 19.42/0.80 19.8 19.42 CH3 27 0.81 d (6.5, 3H) 19.71/ 0.81 20.2 19.71 CH3 28 0.88 d (7.0, 3H) 17.25/ 0.88 17.8 17.25 CH3 29 4.48 d (5.5, 1H) OH 30 4.22 d (5.5, 1H) OH 31 3.58 s, 1H OH
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
Từ những kết quả nghiên cứu ở trên, chúng tôi kết luận rằng:
Trong cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) đã phát hiện đƣợc 17 loại nấm nội sinh có hình thái và đặc điểm sinh trƣởng, phát triển khác nhau. Trong số đó đã xác định phân loại đƣợc 4 chủng nấm nội sinh: 1 chủng thuộc vào chi Trichodema, 3 chủng thuộc vào chi Fusarium. Những chủng nấm nội sinh này đã từng đƣợc phân lập từ các đối tƣợng thực vật khác và cho ra những kết quả khoa học thú vị.
Nghiên cứu các hợp chất thiên của của chủng nấm Fusarium sp. (B1) trong cây nghệ vàng, chúng tôi xác định đƣợc cặn chiết MeOH của chủng nấm này có tác dụng ức chế khá cao sự sinh trƣởng, phát triển của nấm gây bệnh thối xám (Botrytis cinera) ở nồng độ 1500 ppm so với đối chứng là 56,5%. Chúng tôi đã xác định đƣợc cấu trúc hóa học của 14 chất hóa học có trong chủng nấm. Trong đó, có 12 loại acid (chất 1-12), chất 13 (β-sitosterol) là chất rất phổ biến trong các đối tƣợng thực vật cũng có trong nấm nội sinh, 1 chất 14 ((24R)-Methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol) đã đƣợc tìm thấy trong một loài san hô mềm Sinularia sp.
Kiến nghị:
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy nghiên cứu nấm nội sinh là hƣớng nghiên cứu có tiềm năng rất lớn. Đặc biệt là trong lĩnh vực hợp chất thiên nhiên nhằm tìm ra những hợp chất mới và trong lĩnh vực y học với mục đích tìm ra nguồn cung cấp mới tạo ra những hợp chất điều trị bệnh. Vì vậy nên chúng tôi đề nghị đƣợc tiếp tục đƣợc nghiên cứu về chủng loài của các chủng nấm nội sinh còn lại và phân lập các hợp chất tự nhiên trong nấm nội sinh. Ngoài ra, các hợp chất đã tách chiết đƣợc cần thử các hoạt tính sinh học khác nhƣ: kháng vi khuẩn, kháng viêm, chống ung thƣ,...
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1]. Võ Văn Chi (1997),(2012), 300, “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, Nxb. Y học, Hà Nội, 267-270.
[2]. Trần Thị Nhƣ Hằng và cộng sự, (2009), Xác định cấu trúc và thử hoạt tính sinh học của ergosterol perxod phân lập từ chủng nấm Trichoderma konilangbra nội sinh trên cây Khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep), Tạp chí dƣợc học (400), trang 60-65.
[3]. Lê Mai Hƣơng và cộng sự, (2005), Phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn các chủng nấm nội sinh thực vật phân lập từ một số vườn thuốc phía Bắc Việt Nam, Tạp chí dƣợc học (352), trang 20-23.
[4]. Nguyễn Đinh Nga và cs (2010), Sàng lọc vi nấm nội sinh thực vật kháng Candida albicans,Tạp chí Y – Dƣợc học quân sự. 4, 17-24.
[5] Phạm Quang Thu, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Xuân Hƣng, Nguyễn Văn Nam, (2012), “Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh và các hợp chất hóa học có hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở các dòng Keo tai tượng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, số 2, 2243-2252.
[6] Đàm Sao Mai, Võ Trung Âu, (2014), “Nghiên cứu phân lập và xác lập môi trường nuôi cấy phân lập vi nấm cộng sinh phân lập từ cây thông đỏ tại vùng Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng”, Tạp chí Sinh học, 36(1se), 84-89.
Tài liệu tiếng Anh
[7] Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amritapuri, Kollam 690525, Kerala, India, (2015), “Pharmacollogical profile of mangrove endophytes – a review”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences Vol 7, Issue 1, 6-15.
[8] Aswathy A. J., Jasim B., Jyothis M., Radhakrishnan E.K., (2012), “Identification of two strains of Paenibacillus sp. as indole 3 acetic acid- producing rhizome-associated endophytic bacteria from Curcuma longa”,
School of Biosciences, Mahatma Gandhi University, Priyadarshini Hills, Kottayam, Kerala, India, 686 – 560.
[9] Carroll G., (1988), “Fungal endophytes in stems and leaves: from latent pathogen to mutualistic symbiont”, Ecol, 69, 2-9.
[10] Carroll G.C., Tudzynski P, (1997), “Fungal phytohormones in pathogenic and mutualistic associations”, The Mycota V: plant relationships part A. Berlin: SpringerVerlag, 167–184.
[11] Castillo U.F., Strobel G.A., Ford E.J., Hess W.M., Porter H., Jensen J.B., Albert H., Robison R., Condron M.A.M., Teplow D.B.,Stevens D., Yaver D.,(2002) “Munumbicins, wide spectrum antibiotics produced by Streptomyces (NRRL 30562) endophytic on Kennedia nigriscans” Microbiology 148, 2675–2685.
[12] Cui Y., Yi D., Bai X., Sun B., Zhao Y., Zhang Y., (2012), “Ginkgolide B produced endophytic fungus (Fusarium oxysporum) isolated from Ginkgo biloba”, Fitoterapia, 83, 913–920.
[13] Hammerschmidt L. & cộng sự (2014), “Polyketides from the mangrove- derived endophytic fungus Acremonium strictum”, Tetrahedron Letters, 55, 2463 - 3468.
[14] Huang H., Feng X., Xiao Z., Liu L., Li H., Ma L., Lu Y., Ju J., She Z., Lin Y., (2011), “Azaphilones and p-terphenyls from the mangrove endophytic fungus Penicillium chermesinum (ZH4-E2) isolated from the South China Sea”, J Nat Prod, 74(5), 997-1002.
[15] Joel E.L., Bhimba B.V., (2011) “In vitro anti-inflammatory activity of mangrove associated fungi”, J Pharm Res, 4(9), 2900-2901.
[16] John G.O., Gregory L.H., Otto D.H., Michael A.G., và cộng sự, (1997), “Nodulisporic Acid A, a Novel and Potent Insecticide from a NodulisporiumSp. Isolation, Structure Determination, and Chemical Transformations”, J. Am. Chem. Soc, 119, 8809-8816.
[17] Kjer J., Debbab A., Amal H.A. & Proksch P., (2010), “Methods for isolation of marine-derived endophytic fungi and their bioactive secondary products”, Nature protocols , vol.5, no.3, 479–490.
[18] Kobayashi M., Krishna M., Anjaneyulu V, “ Isolation of 24-
methylenecholestane-1α, 3β, 5 α, 6 β, 16β - pentol from Sinularia sp. of soft coral”, Marine sterols. XXIV, Chem. Pharm. Bull., 40, 2845–2846.
[19] Kusari S., Zühlke S., Spiteller M., (2009), “An endophytic fungus from Camptotheca acuminata that produces camptothecin and analogues”, J Nat Prod, 72(1), 2-7.
[20] Li W., Zhou J., Lin Z., Hu Z., (2007), “Study on fermentation condition for production of huperzine A from endophytic fungus 2F09P03B of Huperzia serrata” Chinese Medicinal Biotechnology, 2, 254-259.
[21] O’Sullivan D. J., O’Gara F., (1992), “Traits of fluorescent Pseudomonas spp. involved in suppression of plant root pathogens”, Microbiol Rev, 56, 662–676.
[22] Raviraja N.S., (2005), “Fungal endophytes in five medicinal plant species from Kudremukh Range, Western Ghats of India”, J Basic Microbiol, 45(3), 230-235.
[23] Richardson A. E., Barea J. M., McNeill A.M., Prigent-Combaret C.. (2009), “Acquisition of phosphorus and nitrogen in the rhizosphere and plant growth promotion by microorganisms”, Plant Soil, 321, 305–339.
[24] Ryan R.P., Germaine K., Franks A., Ryan D.J., Dowling D.N., (2008), “Bacterial endophytes: recent developments and applications”, FEMS Microbiol Lett, 278, 1–9.
[25] Sean F. B. and Clardy J., (2000) “CR377, a new pentaketide antifungal agent isolated from an endophytic fungus”, J. Nat. Prod., 63 (10), 1447–1448.
[26] Shukla S. T., Habbu P. V., Kulkarni V. H., Jagadish K. S., Pandey A. R., Sutariya V. N., (2014), “Endophytic microbes: a novel source for biologically/pharmacologically active secondary metabolites”, Asian J Pharmacol Toxicol, 2(3), 1-16.
[27] Song Y., Wang J., Huang H., Ma L. và cộng sự, (2012), “Four eremophilane sesquiterpenes from the mangrove endophytic fungus Xylaria sp. BL321”, Mar Drugs, 10(2), 340–348.
[28] Stierle A., Strobel G. A. & Stierle D., (1993), “Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pacific yew”, Science, 260, 214–216.
[29] Strobel G. A., Stierle A., Stierle D. & Hess W. M., (1993), “Taxomyces andreanaea proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew”, Mycotaxon, 47, 71–80.
[30] Strobel G. and Daisy B., (2003), “Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products”, Microbiol Mol Biol Rev, 67(4), 491– 502.
[31] Strobel G., (2006), “Muscodor albus and its biological promise”, J Ind Microbiol Biotechnol”, 33(7), 514-522.