3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo
- Vật liệu nghiên cứu là mảnh lá, cuống lá, lát cắt đoạn thân sạch của cây đu đủ thu được sau khi khử trùng được cắt với kích thước dài khoảng 0,3 - 0,5cm đối với đoạn thân và cuống lá, 0,3 x 0,3cm với mảnh lá.
- Phương pháp tiến hành: cấy các nguyên liệu đã chuẩn bị vào môi trường MS có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như NAA, IBA, hoặc tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và NAA với các nồng độ khác nhau để nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo. Nồng độ NAA được bổ sung từ 0,5 mg/l - 1mg/l - 2 mg/l, BAP có nồng độ từ: 0,5mg/l -1,0 mg/l - 2,0 mg/l.
- Thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 4 bình, mỗi bình từ 4-7 mẫu.
- Thời gian theo dõi: 30 ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo mô sẹo, đặc điểm mô sẹo, tốc độ sinh trưởng phát triển của mô sẹo.
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo
2.3.3.1.Phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo
- Vật liệu thí nghiệm: mô sẹo có nguồn gốc từ mảnh lá, đoạn thân và cuống lá thu được trong thí nghiệm tạo mô sẹo.
- Phương pháp tiến hành: cấy chuyển mô sẹo đã hình thành vào môi trường MS có bổ sung có bổ sung NAA dải nồng độ là 0 mg/l, 0,1 mg/l và 0,25 mg/l, BAP có nồng độ là 0 mg/l, 0,5 mg/l và 1,0 mg/l.
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 6 mẫu. Theo dõi các chỉ tiêu đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo, tỷ lệ tái sinh chồi, chất lượng chồi sau 30 ngày.
2.3.3.2. Phương pháp nhân nhanh chồi
- Vật liệu thí nghiệm: chồi non in vitro
- Phương pháp tiến hành: cấy chuyển chồi đã hình thành vào môi trường MS có bổ sung nước dừa 5% và bổ sung NAA với nồng độ 0,1 mg/l, 0,25 mg/l, BA với nồng độ 0,5 mg/l, 1,0 mg/l.
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 4 mẫu. Theo dõi các chỉ tiêu hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá/chồi, đặc điểm hình thái chồi sau 30 ngày.
2.3.4. Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh
-Vật liệu thí nghiệm: chồi sau khi nhân nhanh đã có từ 2 lá trở lên. - Phương pháp tiến hành: chồi được cấy vào môi trường tạo rễ MS có bổ sung than hoạt tính 0,5 g/l, NAA với các nồng độ 0,5 mg/l, 1,0 mg/l, 2,0 mg/l hoặc bổ sung IBA với các nồng độ 1,0 mg/l, 1,5 mg/l, 2,0 mg/l.
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 3 bình, mỗi bình 3 mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ ra rễ, tỷ lệ không ra rễ.
2.4. Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các yếu tố vật lý như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định.
- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25oC ± 2oC. Độ ẩm: 60 – 70 %.
- Ánh sáng: cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 12-16 giờ/ngày.
2.5. Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên máy tính bằng phần mềm Microsoft Excel và trình ứng dụng Statgraphics centurion XV.I. Các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khác nhau (a, b, c,…) trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo phép kiểm định Duncan với p < 0,05.
- Giá trị trung bình (X ): n i i X n X 1 1 - Độ lệch chuẩn ( ): 1 ) ( 1 2 n X X n i i
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ khử trùng mẫu cấy
3.1.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu
Trong quy trình nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thì khâu khử trùng mẫu từ ngoài tự nhiên để đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro là khó khăn và mất tương đối nhiều thời gian do các mẫu này thường mang nhiều nguồn bệnh như nấm, vi khuẩn và khả năng chống chịu với các hóa chất khử trùng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu 03 chế độ khử trùng sử dụng HgCl2 với các nồng độ 0,1% và 0,15% với các khoảng thời gian khác nhau để khử trùng đoạn chồi ngọn của cây đu đủ đực để đưa mẫu vào nuôi cấy. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1.
Kết quả thu được ở bảng 3.1 cho thấy các chế độ khử trùng khác nhau đã cho hiệu quả khử trùng (tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu sống) có sự khác biệt nhau rõ rệt. Qua theo dõi cho thấy tỷ lệ mẫu sạch và sống thu được ở cả ba chế độ khử trùng đạt được tương đối thấp chỉ từ 27,78% -55,17% ở tuần đầu tiên. Sau đó tỷ lệ mẫu sạch và sống sẽ giảm dần theo thời gian theo dõi sau 2 và 4 tuần do tỷ lệ nhiễm và chết tăng lên.
Đối với tỷ lệ mẫu sạch: tỷ lệ mẫu sạch thu được ở cả ba chế độ khử trùng đạt được tương đối thấp chỉ từ 27,78% đến 74,14% ở tuần đầu tiên. Với chế độ 1: Tỷ lệ mẫu sạch đạt được ở tuần 1 rất cao đạt 74,14%, nhưng sau đó giảm xuống tuần 2 đến tuần 4 (chỉ còn 53,45% và 46,55%).Với chế độ khử trùng 2: tỷ lệ mẫu sạch thu được khá cao ở tuần đầu (52,63%), đến 2 tuần tỷ lệ mẫu sạch giảm xuống còn 42,11% và ổn định cho đến 4 tuần. Còn chế độ khử trùng 3: tỷ lệ mẫu sạch thu được rất thấp, chỉ đạt 27,78% ở tuần 1 và tiếp tục giảm sau 2 và 4 tuần (lần lượt chỉ đạt 26,38% và 25,0%).
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng đối với ngọn đu đủ
Thời gian
nuôi cấy Số mẫu
Tỷ lệ sạch (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ nhiễm (%) CĐ 1: Chế độ khử trùng 1: HgCl2 0,1% trong 15 phút 1 tuần 58 74,14 55,17 18,96 25,86 2 tuần 58 53,45 29,31 24,14 46,55 4 tuần 54 46,55 22,41 24,14 53,45 CĐ2: Chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15% trong 13 phút 1 tuần 76 52,63 42,10 10,53 47,37 2 tuần 76 42,11 31,58 10,53 57,89 4 tuần 76 42,11 31,58 10,53 57,89 CĐ3: Chế độ khử trùng 1: HgCl2 0,1% trong 10 phút (lần 1) và 5 phút (lần 2) 1 tuần 72 27,78 27,78 0 72,22 2 tuần 72 26,38 19,44 6,9 73,61 4 tuần 72 25,0 18,05 6,9 75,0
Đối với tỷ lệ mẫu sống: trong 3 chế độ khử trùng nghiên cứu thì chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất sau 2 đến 4 tuần theo dõi (đạt 31,58%), cao hơn chế độ 1 và chế độ 3 (tương ứng là 22,41% và 18,05%). Chế độ khử trùng 1, tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất ở tuần đầu (55,17%) nhưng giảm dần ở các tuần tiếp theo do tỷ lệ mẫu chết tăng. Chế độ khử trùng 3 có tỷ lệ mẫu sống đạt thấp nhất so với cả CĐ1 và CĐ2 do tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất.
Đối với tỷ lệ mẫu nhiễm: qua theo dõi các chế độ khử trùng đến tuần thứ 4 cho thấy: Chế độ khử trùng 1 và 2 cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp hơn và chênh lệch không nhiều (53,45% và 57,89% ở tuần thứ 4). Chế độ khử trùng 3 cho tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao (75,0% ở tuần thứ 4). Hơn nữa, chế độ khử trùng 1 và chế độ khử trùng 3 khi theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm tăng từ tuần 1 đến đến tuần thứ 4. Với chế độ khử trùng 1, tỷ lệ nhiễm đạt lần lượt là 25,86%, 46,55%, 53,45 %. Chế độ khử trùng 3, tỷ lệ mẫu nhiễm từ tuần 1 đến tuần 2 và tuần 3 là 72,22%, 73,61% và 75,0%. Chế độ khử trùng 2, tỷ lệ mẫu nhiễm tuần 1 là 47,37%. Đến tuần 2 tăng lên 57,89%, tuần 3 không phát hiện thêm mẫu nhiễm.
Như vậy, chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15 % trong 13 phút cho là phù hợp cho khử trùng mẫu ngọn đu đu đực với tỷ lệ mẫu sạch sống đạt cao nhất 31,58% sau 4 tuần nuôi cấy.
Có nhiều hóa chất khác nhau đã được lựa chọn để khử trùng mẫu đu đủ như: Ca(OCl)2 NaClO, HgCl2 và đã thu được các kết quả khử trùng khác nhau đối với các giống đu đủ khác nhau như: theo Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (2004): Phương thức khử trùng có hiệu quả nhất là khử trùng kép (Khử trùng Ca(OCl)2 trước, sau đó khử trùng tiếp bằng HgCl2), tỷ lệ mẫu sạch đạt 60% đối với mẫu cây lấy từ vườn sản xuất và 78% khi các mẫu lấy từ vườn ươm sau 12 ngày nuôi cấy. Công thức HgCl2 2 trong 3 phút, tỷ lệ mẫu sạch đạt 20% với mẫu từ vườn ươm và 10% với mẫu từ vườn sản xuất [16] . Theo Đỗ Văn Nam và cộng sự (2013) khi nhân nhanh in vitro dòng bố của giống VNĐĐ9 từ vật liệu đoạn thân mang chồi nách đã kết luận chế độ khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút (lần 1) và lần 2 trong thời gian 5 phút cho tỷ lệ 86,9 % mẫu sạch [15].
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ mẫu sạch thu được thấp hơn các nghiên cứu khác nhưng thời gian theo dõi của chúng tôi lâu hơn đến 4 tuần.
Các mẫu sạch sau khi khử trùng khoảng 4 tuần được cấy chuyển sang môi trường tạo mô sẹo. Trên môi trường tạo mô sẹo, một số mẫu lại thấy vi khuẩn phát triển mạnh ở quanh mẫu. Điều này chứng tỏ vi khuẩn chứa trong mạch của mô đu đủ rất khó loại bỏ khi khử trùng. Tỉ lệ mẫu sạch hoàn toàn thu được sẽ giảm dần theo thời gian theo dõi. Đây là khó khăn lớn cho việc vào mẫu đu đủ. Trước đây những thí nghiệm sơ khởi cho thấy xử lý mẫu bằng Natri hypochlorit không hiệu quả với phần bên trong mẫu. Việc sử dụng chất kháng sinh RIF có tác động đến bên trong mẫu ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn [20].
Kết luận: chế độ khử trùng 2, HgCl2 0,15% trong 13 phút là phù hợp để khử trùng đưa mẫu đu đủ đực vào nuôi cấy .
A B
Hình 3.1 Mẫu trước và sau khử trùng
A) Mẫu trước khi khử trùng, B) Mẫu sau khi khử trùng cấy vào ống nghiệm
3.1.2. Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu đến hiệu quả khử trùng
Chúng tôi thu mẫu đu đủ ở các độ tuổi khác nhau là ngọn non (phân biệt giới tính chủ yếu dựa vào hình thái rễ) và ngọn đã bắt đầu phân hóa mầm hoa (mới ra nụ, ra hoa) để khử trùng đưa vào nuôi cấy in vitro. Kết quả cho thấy độ tuổi mẫu đã có ảnh hưởng khá rõ rệt đến hiệu quả khử trùng. Kết quả chỉ ra ở bảng 3.2.
Qua kết quả ở bảng 3.2 cho thấy hiệu quả khử trùng đạt được cao nhất khi mẫu đu đủ còn non chưa có hoa và giảm dần khi độ tuổi mẫu tăng lên (từ bắt đầu phân hóa mầm hoa, mới ra hoa,ngọn vừa, ra hoa, ngọn to).
Đối với ngọn non (ngọn chưa phân hóa mầm hoa): khi khử trùng thu được hiệu quả khá cao, tỷ lệ mẫu sạch đạt cao nhất (Tỷ lệ sạch đạt 60,71% sau 2 tuần và 50,0% sau 4 tuần; Tỷ lệ sống đạt 57,14% sau 2 tuần và 42,86% sau 4 tuần).
Đối với mẫu ngọn đu đực mới ra nụ hoa: thu được hiệu quả khử trùng khá cao, tỷ lệ mẫu sạch đạt 53,45% sau 2 tuần và 46,55% sau 4 tuần; Tỷ lệ sống đạt 29,31% sau 2 tuần và 22,41% sau 4 tuần. Đối với mẫu đu đủ ra hoa (ngọn vừa và ngọn to) có tỷ lệ mẫu bị nhiễm chiếm từ 80% đến 86,11% sau 4 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ mẫu sạch và sống đạt được rất thấp, chỉ từ 16,67% đến 6,94% sau 4 tuần.
Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi mẫu đến hiệu quả khử trùng sau 2-4 tuần nuôi cấy
Độ tuổi mẫu Thời
gian Số mẫu Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sạch (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Ngọn non 2 tuần 38 39,29 60,71 57,14 3,57 4 tuần 38 50,00 50,00 42,86 7,14 Mới ra nụ hoa 2 tuần 58 46,55 53,45 29,31 24,14 4 tuần 58 53,45 46,55 22,41 24,14 Ra hoa, ngọn vừa 2 tuần 30 70,00 30,00 16,67 3,33 4 tuần 30 80,00 20,00 16,67 3,33 Ra hoa, ngọn 2 tuần 72 77,78 22,22 15,27 6,9
rất to 4 tuần 72 86,11 13,89 6,94 6,9
Chế độ khử trùng: HgCl2 0,15% trong 13 phút đối với tất các lô thí nghiệm
Điều này cho thấy nên lấy mẫu khi còn non, ngọn bắt đầu phân hóa (nhận rõ đu đủ đực) thì sẽ cho hiệu quả khử trùng tốt hơn là lấy mẫu trưởng thành và đã phân hóa rõ giới tính, nhất là khi ngọn to và thân đã rỗng sẽ cho hiệu quả khử trùng rất thấp vì có thể do vi khuẩn lan trong mô ruột của đu đủ dẫn đến tỉ lệ nhiễm rất cao. Theo Ngô Xuân Bình (2010), các mô phân sinh đỉnh ở các cây bị nhiễm bệnh thường là sạch bệnh hoặc chứa nồng độ virus rất thấp. Tuy nhiên, nồng độ của virus trong cây tăng lên tương ứng với việc tăng khoảng cách từ các đỉnh phân sinh. Các lý do khác nhau để cho mô phân sinh không hoặc ít bị virus xâm nhiễm là các virus di chuyển dễ dàng trong cơ thể thực vật thông qua hệ thống mạch dẫn là cấu trúc mà ở đỉnh phân sinh không có; Hoạt tính trao đổi chất cao trong quá trình phân chia của các tế bào phân sinh ngăn cản sự sao chép của virus; Nồng độ auxin nội sinh cao ở trong các đỉnh chồi có thể ức chế sinh sản của virus [2].
Như vậy với chế độ khử trùng HgCl2 0,15% trong 13 phút với thời gian theo dõi 4 tuần có thể kết luận độ tuổi mẫu phù hợp cho hiệu quả khử trùng tốt nhất là mẫu còn non (chưa ra hoa).
Theo Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (2004) hiệu quả khử trùng các nguyên liệu khác nhau đạt được khác nhau. Tỷ lệ mẫu sạch đạt 60% đối với mẫu cây lấy từ vườn sản xuất và 78% khi các mẫu lấy từ vườn ươm sau 12 ngày nuôi cấy (đối với chế độ khử trùng kép). Tỷ lệ mẫu sạch đạt 20% với mẫu từ vườn ươm và 10% với mẫu từ vườn sản xuất đối với chế độ khử trùng bằng HgCl2 trong 3 phút [16].
Rohman và cộng sự (2007), khi nhân giống vô tính từ chồi nách của các cây đu đủ trưởng thành đã tiến hành lắc mẫu trong L-rifampicin 300 mg/l trong 2 giờ trước khi đưa vào khử trùng bề mặt. Kết quả nghiên cứu cho thấy
tỷ lệ sống cao nhất trong môi trường MS bổ sung BAP 1 mg/l, NAA 0,2 mg/l đạt 53,33% [51]. Đỗ Văn Nam và cộng sự (2013) đã ngâm mẫu trong cefotaxim trong 3 giờ trước khi khử trùng bằng HgCl2 0,1 %, Ca(OCl)2 5% và NaOCl 5,5% [15].
Điều này cho thấy hiệu quả khử trùng ngoài phụ thuộc vào hóa chất khử trùng, nồng độ và thời gian xủa lí hóa chất, còn phụ thuộc rất lớn vào mẫu, độ tuổi cũng như kiểu gen.
A B
Hình 3.2.Khử trùng mẫu với các độ tuổi khác nhau
A ) Ngọn non, B) Ngọn mới ra nụ
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (IAA, NAA, BAP và NAA) đến khả năng hình thành mô sẹo NAA, BAP và NAA) đến khả năng hình thành mô sẹo
3.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến khả năng tạo mô sẹo sau 40 ngày
Nguyên liệu Số mẫu Tỷ lệ mẫu tạo callus (%) Đặc điểm mô sẹo Điểm hình thành mô sẹo Tốc độ sinh trưởng mô sẹo
Đoạn thân 40 100a± 0,0 Trắng đến xanh nhạt, rắn Bề mặt trên mẫu ++ Cuống lá 38 86,65b ± 4,74 Xanh nhạt, rắn Gốc cuống +
Mảnh lá 40 19,50c ± 0,71 Trắng bông, mềm
Đầu cuống lá
++
Các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khác nhau (a, b, c,…) trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo phép kiểm định Duncan với p < 0,05.
Đoạn thân, mảnh lá và cuống lá của chồi đu đủ được nuôi cấy trên môi