Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

3. Nội dung nghiên cứu

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Đỗ Văn Nam và các cộng sự (2013) đã nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro cây đu đủ dòng bố của giống VNĐĐ9 từ đoạn thân mang chồi nách. Kết quả đã xác định được chế độ khử trùng thích hợp là khử trùng kép bằng HgCl2 0,1 % lần 1 trong thời gian 10 phút và lần 2 trong thời gian 5 phút. Chế độ khử trùng này cho 86,9% mẫu sạch. Môi trường thích hợp nhất để tạo callus từ lát cắt đoạn thân là MS bổ sung α-NAA 1 mg/l và BA 0,5 mg/l, tỷ lệ hình thành callus đạt 90,74 % sau 4 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ callus tái sinh chồi cao nhất (44,44 %) trên môi trường MS có BA 1 mg/l và α- NAA 0,1 mg/l. Hệ số nhân chồi đạt cao nhất (3,17 lần) trên môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l và α-NAA 0,25 mg/l sau 4 tuần nuôi cấy. Môi trường thích hợp để cảm ứng tạo rễ cho chồi in vitro là MS ½ bổ sung 1mg/l than hoạt tính và IBA 1,5 mg/l cho tỷ lệ chồi tạo rễ cao nhất đạt 50% sau 4 tuần nuôi cấy [15].

Phan Đình Kim Thư và cộng sự đã nghiên cứu kỹ thuật sản xuất cây giống đu đủ in vitro lưỡng tính. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Đối với vật liệu

là lá trên chồi thân từ cây trưởng thành, trong môi trường MS ½ có bổ sung sucrose 30 g/l với glutamine 400 mg/l và agar 8 g/l, BAP 0,02 mg/l và 2,4-D 1 mg/l cho kết quả tốt nhất trong tạo mô sẹo. Môi trường để nuôi cấy kích thích hình thành phôi soma là MS bổ sung sucrose 30 g/l, agar 8 g/l, BAP 0,5 mg/l, NAA 0,1 mg/l cho kết quả tốt nhất trong kích thích mô sẹo hình thành phôi. Môi trường để nuôi cấy kích thích phôi nảy mầm là MS bổ sung sucrose 30 g/l, không cần bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng.Trạng thái lỏng lắc cho kết quả tốt nhất trong kích thích phôi nảy mầm. Môi trường để nuôi cấy kích thích phôi đã nảy mầm phát triển thành cây hoàn chỉnh là MS bổ sung sucrose 30 g/l. Không cần bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng. Trạng thái đặc cho kết quả tốt nhất trong kích thích phôi đã nảy mầm phát triển thành cây hoàn chỉnh [20].

Nguyễn Thị Nhẫn và cs (2004) đã nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro cây đu đủ. Phương thức khử trùng tốt nhất với cây đu đủ là kết hợp Ca(OCl)2 0,15% với HgCl2 0,1% sau đó đưa vào nuôi cấy trên môi trường MS có BA 1ppm hoặc BA 0,5 ppm và kinetin 0,5 ppm. Sử dụng môi trường MS bổ sung NAA 0,2 ppm và BA 0,5 ppm với nước dừa (5%) đạt được hệ số nhân chồi từ 4,4 đến 4,6 lần. Tỷ lệ chồi ra rễ trên môi trường NAA 0,025 ppm là 95% sau 4 tuần nuôi cấy [16].

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu thực vật

Đoạn chồi ngọn cây đu đủ đực có độ tuổi khác nhau được thu thập từ các vườn dược liệu ở tỉnh Tuyên Quang.

A B C

Hình 2.1. Cây đu đủ đực dùng trong nghiên cứu

A) Cây giống từ vườn ươm, B) Cây nhỏ, C) Cây lớn

2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm a) Hóa chất a) Hóa chất

Các thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS gồm khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin (Murashige và Skoog, 1962).

-Môi trường: MS có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng và nước dừa, agar

-Chất điều hòa sinh trưởng: 2,4 D, NAA, IBA (Sigma, Đức).

-Hợp chất hữu cơ: cao nấm men, peptone (Phytech, USA), nước dừa. -Hóa chất khác: đường sucrose, agar (Hạ Long, Việt Nam)

-Than hoạt tính.

-Hóa chất khử trùng (cồn 70%, thủy ngân HgCl2 0,1%, hypoclrit canxi Ca(OCl)2).

-Cân điện tử. -Nồi hấp khử trùng. -Tủ sấy. -Tủ cấy vô trùng cấp -Máy đo pH. -Lò vi sóng.

Ngoài ra còn một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên.

2.2. Địa điểm và thời gian

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu: các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8/2017 - tháng 4/2019

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy.

- Vật liệu thí nghiệm: đoạn ngọn chứa chồi nách của cây đu đực với các độ tuổi khác nhau từ cây non đến cây trưởng thành (chưa ra hoa hoặc đang có hoa).

- Phương pháp tiến hành: mẫu thu về rửa sạch dưới vòi nước chảy, ngâm trong xà phòng loãng khoảng 15 phút, tiếp theo rửa sạch xà phòng sau đó tráng bằng nước cất, mang vào box cấy để khử trùng. Ở trong box cấy vô trùng; khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 1-2 phút, tráng sạch bằng nước cất khử trùng 3-4 lần sau đó khử trùng bằng thủy ngân clorua HgCl2 với các nồng độ 0,1%, 0,15% và trong các khoảng thời gian khác nhau 13 phút, 15 phút hoặc 10 phút (lần 1) và 5 phút (lần 2).

- Chỉ tiêu nghiên cứu: xác định tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết.

- Vật liệu nghiên cứu là mảnh lá, cuống lá, lát cắt đoạn thân sạch của cây đu đủ thu được sau khi khử trùng được cắt với kích thước dài khoảng 0,3 - 0,5cm đối với đoạn thân và cuống lá, 0,3 x 0,3cm với mảnh lá.

- Phương pháp tiến hành: cấy các nguyên liệu đã chuẩn bị vào môi trường MS có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như NAA, IBA, hoặc tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và NAA với các nồng độ khác nhau để nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo. Nồng độ NAA được bổ sung từ 0,5 mg/l - 1mg/l - 2 mg/l, BAP có nồng độ từ: 0,5mg/l -1,0 mg/l - 2,0 mg/l.

- Thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 4 bình, mỗi bình từ 4-7 mẫu.

- Thời gian theo dõi: 30 ngày.

- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo mô sẹo, đặc điểm mô sẹo, tốc độ sinh trưởng phát triển của mô sẹo.

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

2.3.3.1.Phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo

- Vật liệu thí nghiệm: mô sẹo có nguồn gốc từ mảnh lá, đoạn thân và cuống lá thu được trong thí nghiệm tạo mô sẹo.

- Phương pháp tiến hành: cấy chuyển mô sẹo đã hình thành vào môi trường MS có bổ sung có bổ sung NAA dải nồng độ là 0 mg/l, 0,1 mg/l và 0,25 mg/l, BAP có nồng độ là 0 mg/l, 0,5 mg/l và 1,0 mg/l.

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 6 mẫu. Theo dõi các chỉ tiêu đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo, tỷ lệ tái sinh chồi, chất lượng chồi sau 30 ngày.

2.3.3.2. Phương pháp nhân nhanh chồi

- Vật liệu thí nghiệm: chồi non in vitro

- Phương pháp tiến hành: cấy chuyển chồi đã hình thành vào môi trường MS có bổ sung nước dừa 5% và bổ sung NAA với nồng độ 0,1 mg/l, 0,25 mg/l, BA với nồng độ 0,5 mg/l, 1,0 mg/l.

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 4 mẫu. Theo dõi các chỉ tiêu hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá/chồi, đặc điểm hình thái chồi sau 30 ngày.

2.3.4. Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh

-Vật liệu thí nghiệm: chồi sau khi nhân nhanh đã có từ 2 lá trở lên. - Phương pháp tiến hành: chồi được cấy vào môi trường tạo rễ MS có bổ sung than hoạt tính 0,5 g/l, NAA với các nồng độ 0,5 mg/l, 1,0 mg/l, 2,0 mg/l hoặc bổ sung IBA với các nồng độ 1,0 mg/l, 1,5 mg/l, 2,0 mg/l.

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 3 bình, mỗi bình 3 mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ ra rễ, tỷ lệ không ra rễ.

2.4. Điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các yếu tố vật lý như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định.

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25oC ± 2oC. Độ ẩm: 60 – 70 %.

- Ánh sáng: cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 12-16 giờ/ngày.

2.5. Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên máy tính bằng phần mềm Microsoft Excel và trình ứng dụng Statgraphics centurion XV.I. Các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khác nhau (a, b, c,…) trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo phép kiểm định Duncan với p < 0,05.

- Giá trị trung bình (X ):    n i i X n X 1 1 - Độ lệch chuẩn ( ): 1 ) ( 1 2      n X X n i i 

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ khử trùng mẫu cấy

3.1.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu

Trong quy trình nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thì khâu khử trùng mẫu từ ngoài tự nhiên để đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro là khó khăn và mất tương đối nhiều thời gian do các mẫu này thường mang nhiều nguồn bệnh như nấm, vi khuẩn và khả năng chống chịu với các hóa chất khử trùng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu 03 chế độ khử trùng sử dụng HgCl2 với các nồng độ 0,1% và 0,15% với các khoảng thời gian khác nhau để khử trùng đoạn chồi ngọn của cây đu đủ đực để đưa mẫu vào nuôi cấy. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1.

Kết quả thu được ở bảng 3.1 cho thấy các chế độ khử trùng khác nhau đã cho hiệu quả khử trùng (tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu sống) có sự khác biệt nhau rõ rệt. Qua theo dõi cho thấy tỷ lệ mẫu sạch và sống thu được ở cả ba chế độ khử trùng đạt được tương đối thấp chỉ từ 27,78% -55,17% ở tuần đầu tiên. Sau đó tỷ lệ mẫu sạch và sống sẽ giảm dần theo thời gian theo dõi sau 2 và 4 tuần do tỷ lệ nhiễm và chết tăng lên.

Đối với tỷ lệ mẫu sạch: tỷ lệ mẫu sạch thu được ở cả ba chế độ khử trùng đạt được tương đối thấp chỉ từ 27,78% đến 74,14% ở tuần đầu tiên. Với chế độ 1: Tỷ lệ mẫu sạch đạt được ở tuần 1 rất cao đạt 74,14%, nhưng sau đó giảm xuống tuần 2 đến tuần 4 (chỉ còn 53,45% và 46,55%).Với chế độ khử trùng 2: tỷ lệ mẫu sạch thu được khá cao ở tuần đầu (52,63%), đến 2 tuần tỷ lệ mẫu sạch giảm xuống còn 42,11% và ổn định cho đến 4 tuần. Còn chế độ khử trùng 3: tỷ lệ mẫu sạch thu được rất thấp, chỉ đạt 27,78% ở tuần 1 và tiếp tục giảm sau 2 và 4 tuần (lần lượt chỉ đạt 26,38% và 25,0%).

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng đối với ngọn đu đủ

Thời gian

nuôi cấy Số mẫu

Tỷ lệ sạch (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ nhiễm (%) CĐ 1: Chế độ khử trùng 1: HgCl2 0,1% trong 15 phút 1 tuần 58 74,14 55,17 18,96 25,86 2 tuần 58 53,45 29,31 24,14 46,55 4 tuần 54 46,55 22,41 24,14 53,45 CĐ2: Chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15% trong 13 phút 1 tuần 76 52,63 42,10 10,53 47,37 2 tuần 76 42,11 31,58 10,53 57,89 4 tuần 76 42,11 31,58 10,53 57,89 CĐ3: Chế độ khử trùng 1: HgCl2 0,1% trong 10 phút (lần 1) và 5 phút (lần 2) 1 tuần 72 27,78 27,78 0 72,22 2 tuần 72 26,38 19,44 6,9 73,61 4 tuần 72 25,0 18,05 6,9 75,0

Đối với tỷ lệ mẫu sống: trong 3 chế độ khử trùng nghiên cứu thì chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất sau 2 đến 4 tuần theo dõi (đạt 31,58%), cao hơn chế độ 1 và chế độ 3 (tương ứng là 22,41% và 18,05%). Chế độ khử trùng 1, tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất ở tuần đầu (55,17%) nhưng giảm dần ở các tuần tiếp theo do tỷ lệ mẫu chết tăng. Chế độ khử trùng 3 có tỷ lệ mẫu sống đạt thấp nhất so với cả CĐ1 và CĐ2 do tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất.

Đối với tỷ lệ mẫu nhiễm: qua theo dõi các chế độ khử trùng đến tuần thứ 4 cho thấy: Chế độ khử trùng 1 và 2 cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp hơn và chênh lệch không nhiều (53,45% và 57,89% ở tuần thứ 4). Chế độ khử trùng 3 cho tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao (75,0% ở tuần thứ 4). Hơn nữa, chế độ khử trùng 1 và chế độ khử trùng 3 khi theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm tăng từ tuần 1 đến đến tuần thứ 4. Với chế độ khử trùng 1, tỷ lệ nhiễm đạt lần lượt là 25,86%, 46,55%, 53,45 %. Chế độ khử trùng 3, tỷ lệ mẫu nhiễm từ tuần 1 đến tuần 2 và tuần 3 là 72,22%, 73,61% và 75,0%. Chế độ khử trùng 2, tỷ lệ mẫu nhiễm tuần 1 là 47,37%. Đến tuần 2 tăng lên 57,89%, tuần 3 không phát hiện thêm mẫu nhiễm.

Như vậy, chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15 % trong 13 phút cho là phù hợp cho khử trùng mẫu ngọn đu đu đực với tỷ lệ mẫu sạch sống đạt cao nhất 31,58% sau 4 tuần nuôi cấy.

Có nhiều hóa chất khác nhau đã được lựa chọn để khử trùng mẫu đu đủ như: Ca(OCl)2 NaClO, HgCl2 và đã thu được các kết quả khử trùng khác nhau đối với các giống đu đủ khác nhau như: theo Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (2004): Phương thức khử trùng có hiệu quả nhất là khử trùng kép (Khử trùng Ca(OCl)2 trước, sau đó khử trùng tiếp bằng HgCl2), tỷ lệ mẫu sạch đạt 60% đối với mẫu cây lấy từ vườn sản xuất và 78% khi các mẫu lấy từ vườn ươm sau 12 ngày nuôi cấy. Công thức HgCl2 2 trong 3 phút, tỷ lệ mẫu sạch đạt 20% với mẫu từ vườn ươm và 10% với mẫu từ vườn sản xuất [16] . Theo Đỗ Văn Nam và cộng sự (2013) khi nhân nhanh in vitro dòng bố của giống VNĐĐ9 từ vật liệu đoạn thân mang chồi nách đã kết luận chế độ khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút (lần 1) và lần 2 trong thời gian 5 phút cho tỷ lệ 86,9 % mẫu sạch [15].

Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ mẫu sạch thu được thấp hơn các nghiên cứu khác nhưng thời gian theo dõi của chúng tôi lâu hơn đến 4 tuần.

Các mẫu sạch sau khi khử trùng khoảng 4 tuần được cấy chuyển sang môi trường tạo mô sẹo. Trên môi trường tạo mô sẹo, một số mẫu lại thấy vi khuẩn phát triển mạnh ở quanh mẫu. Điều này chứng tỏ vi khuẩn chứa trong mạch của mô đu đủ rất khó loại bỏ khi khử trùng. Tỉ lệ mẫu sạch hoàn toàn thu được sẽ giảm dần theo thời gian theo dõi. Đây là khó khăn lớn cho việc vào mẫu đu đủ. Trước đây những thí nghiệm sơ khởi cho thấy xử lý mẫu bằng Natri hypochlorit không hiệu quả với phần bên trong mẫu. Việc sử dụng chất kháng sinh RIF có tác động đến bên trong mẫu ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn [20].

Kết luận: chế độ khử trùng 2, HgCl2 0,15% trong 13 phút là phù hợp để khử trùng đưa mẫu đu đủ đực vào nuôi cấy .

A B

Hình 3.1 Mẫu trước và sau khử trùng

A) Mẫu trước khi khử trùng, B) Mẫu sau khi khử trùng cấy vào ống nghiệm

3.1.2. Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu đến hiệu quả khử trùng

Chúng tôi thu mẫu đu đủ ở các độ tuổi khác nhau là ngọn non (phân biệt giới tính chủ yếu dựa vào hình thái rễ) và ngọn đã bắt đầu phân hóa mầm hoa (mới ra nụ, ra hoa) để khử trùng đưa vào nuôi cấy in vitro. Kết quả cho