3. Nội dung nghiên cứu
3.1.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu
Trong quy trình nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thì khâu khử trùng mẫu từ ngoài tự nhiên để đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro là khó khăn và mất tương đối nhiều thời gian do các mẫu này thường mang nhiều nguồn bệnh như nấm, vi khuẩn và khả năng chống chịu với các hóa chất khử trùng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu 03 chế độ khử trùng sử dụng HgCl2 với các nồng độ 0,1% và 0,15% với các khoảng thời gian khác nhau để khử trùng đoạn chồi ngọn của cây đu đủ đực để đưa mẫu vào nuôi cấy. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1.
Kết quả thu được ở bảng 3.1 cho thấy các chế độ khử trùng khác nhau đã cho hiệu quả khử trùng (tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu sống) có sự khác biệt nhau rõ rệt. Qua theo dõi cho thấy tỷ lệ mẫu sạch và sống thu được ở cả ba chế độ khử trùng đạt được tương đối thấp chỉ từ 27,78% -55,17% ở tuần đầu tiên. Sau đó tỷ lệ mẫu sạch và sống sẽ giảm dần theo thời gian theo dõi sau 2 và 4 tuần do tỷ lệ nhiễm và chết tăng lên.
Đối với tỷ lệ mẫu sạch: tỷ lệ mẫu sạch thu được ở cả ba chế độ khử trùng đạt được tương đối thấp chỉ từ 27,78% đến 74,14% ở tuần đầu tiên. Với chế độ 1: Tỷ lệ mẫu sạch đạt được ở tuần 1 rất cao đạt 74,14%, nhưng sau đó giảm xuống tuần 2 đến tuần 4 (chỉ còn 53,45% và 46,55%).Với chế độ khử trùng 2: tỷ lệ mẫu sạch thu được khá cao ở tuần đầu (52,63%), đến 2 tuần tỷ lệ mẫu sạch giảm xuống còn 42,11% và ổn định cho đến 4 tuần. Còn chế độ khử trùng 3: tỷ lệ mẫu sạch thu được rất thấp, chỉ đạt 27,78% ở tuần 1 và tiếp tục giảm sau 2 và 4 tuần (lần lượt chỉ đạt 26,38% và 25,0%).
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng đối với ngọn đu đủ
Thời gian
nuôi cấy Số mẫu
Tỷ lệ sạch (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ nhiễm (%) CĐ 1: Chế độ khử trùng 1: HgCl2 0,1% trong 15 phút 1 tuần 58 74,14 55,17 18,96 25,86 2 tuần 58 53,45 29,31 24,14 46,55 4 tuần 54 46,55 22,41 24,14 53,45 CĐ2: Chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15% trong 13 phút 1 tuần 76 52,63 42,10 10,53 47,37 2 tuần 76 42,11 31,58 10,53 57,89 4 tuần 76 42,11 31,58 10,53 57,89 CĐ3: Chế độ khử trùng 1: HgCl2 0,1% trong 10 phút (lần 1) và 5 phút (lần 2) 1 tuần 72 27,78 27,78 0 72,22 2 tuần 72 26,38 19,44 6,9 73,61 4 tuần 72 25,0 18,05 6,9 75,0
Đối với tỷ lệ mẫu sống: trong 3 chế độ khử trùng nghiên cứu thì chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất sau 2 đến 4 tuần theo dõi (đạt 31,58%), cao hơn chế độ 1 và chế độ 3 (tương ứng là 22,41% và 18,05%). Chế độ khử trùng 1, tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất ở tuần đầu (55,17%) nhưng giảm dần ở các tuần tiếp theo do tỷ lệ mẫu chết tăng. Chế độ khử trùng 3 có tỷ lệ mẫu sống đạt thấp nhất so với cả CĐ1 và CĐ2 do tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất.
Đối với tỷ lệ mẫu nhiễm: qua theo dõi các chế độ khử trùng đến tuần thứ 4 cho thấy: Chế độ khử trùng 1 và 2 cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp hơn và chênh lệch không nhiều (53,45% và 57,89% ở tuần thứ 4). Chế độ khử trùng 3 cho tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao (75,0% ở tuần thứ 4). Hơn nữa, chế độ khử trùng 1 và chế độ khử trùng 3 khi theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm tăng từ tuần 1 đến đến tuần thứ 4. Với chế độ khử trùng 1, tỷ lệ nhiễm đạt lần lượt là 25,86%, 46,55%, 53,45 %. Chế độ khử trùng 3, tỷ lệ mẫu nhiễm từ tuần 1 đến tuần 2 và tuần 3 là 72,22%, 73,61% và 75,0%. Chế độ khử trùng 2, tỷ lệ mẫu nhiễm tuần 1 là 47,37%. Đến tuần 2 tăng lên 57,89%, tuần 3 không phát hiện thêm mẫu nhiễm.
Như vậy, chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15 % trong 13 phút cho là phù hợp cho khử trùng mẫu ngọn đu đu đực với tỷ lệ mẫu sạch sống đạt cao nhất 31,58% sau 4 tuần nuôi cấy.
Có nhiều hóa chất khác nhau đã được lựa chọn để khử trùng mẫu đu đủ như: Ca(OCl)2 NaClO, HgCl2 và đã thu được các kết quả khử trùng khác nhau đối với các giống đu đủ khác nhau như: theo Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (2004): Phương thức khử trùng có hiệu quả nhất là khử trùng kép (Khử trùng Ca(OCl)2 trước, sau đó khử trùng tiếp bằng HgCl2), tỷ lệ mẫu sạch đạt 60% đối với mẫu cây lấy từ vườn sản xuất và 78% khi các mẫu lấy từ vườn ươm sau 12 ngày nuôi cấy. Công thức HgCl2 2 trong 3 phút, tỷ lệ mẫu sạch đạt 20% với mẫu từ vườn ươm và 10% với mẫu từ vườn sản xuất [16] . Theo Đỗ Văn Nam và cộng sự (2013) khi nhân nhanh in vitro dòng bố của giống VNĐĐ9 từ vật liệu đoạn thân mang chồi nách đã kết luận chế độ khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút (lần 1) và lần 2 trong thời gian 5 phút cho tỷ lệ 86,9 % mẫu sạch [15].
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ mẫu sạch thu được thấp hơn các nghiên cứu khác nhưng thời gian theo dõi của chúng tôi lâu hơn đến 4 tuần.
Các mẫu sạch sau khi khử trùng khoảng 4 tuần được cấy chuyển sang môi trường tạo mô sẹo. Trên môi trường tạo mô sẹo, một số mẫu lại thấy vi khuẩn phát triển mạnh ở quanh mẫu. Điều này chứng tỏ vi khuẩn chứa trong mạch của mô đu đủ rất khó loại bỏ khi khử trùng. Tỉ lệ mẫu sạch hoàn toàn thu được sẽ giảm dần theo thời gian theo dõi. Đây là khó khăn lớn cho việc vào mẫu đu đủ. Trước đây những thí nghiệm sơ khởi cho thấy xử lý mẫu bằng Natri hypochlorit không hiệu quả với phần bên trong mẫu. Việc sử dụng chất kháng sinh RIF có tác động đến bên trong mẫu ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn [20].
Kết luận: chế độ khử trùng 2, HgCl2 0,15% trong 13 phút là phù hợp để khử trùng đưa mẫu đu đủ đực vào nuôi cấy .
A B
Hình 3.1 Mẫu trước và sau khử trùng
A) Mẫu trước khi khử trùng, B) Mẫu sau khi khử trùng cấy vào ống nghiệm