3. Nội dung nghiên cứu
3.5. Nghiên cứu khả năng tạo rễ cho chồi đu đủ đực
Các chồi sau giai đoạn nhân nhanh với chiều cao chồi 1- 1,2 cm, lá xanh, chồi sinh trưởng phát triển bình thường sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ để hoàn thiện quá trình nhân giống in vitro. Chất cảm ứng ra rễ được sử dụng là IBA với nồng độ 1mg/l, 1,5mg/l, 2,0mg/l và NAA bổ sung với các nồng độ 0,5mg/l, 1,0 mg/l và 2,0 mg/l trên nền môi trường MS bổ sung 0,5g/l than hoạt tính (Bảng 3.7)
Các môi trường nghiên cứu bổ sung NAA gồm môi trường R4, R5 và R6 chồi đều không tạo rễ, chồi sinh trưởng chậm, lá vàng nhạt tương tự như môi trường đối chứng. Nhóm môi trường MS có bổ sung than hoạt tính và IBA, chồi sinh trưởng mạnh hơn với cuống lá dài, màu xanh. Trong ba môi trường nghiên cứu R1, R2 và R3 thì hai môi trường R1 và R3 với nồng độ IBA bổ sung là 1mg/l và 2mg/l đều chưa thấy ra rễ sau 4 tuần theo dõi. Môi trường R2 bổ sung ung IBA 1,5mg/l và than hoạt tính 0,5mg/l sau khoảng 10 ngày đã hình thành rễ, rẽ trắng, ngắn và mập và chỉ có duy nhất 1 rễ. Sau khoảng 4 tuần rễ sinh trưởng dài khoảng 2,0 cm, từ 1 rễ chính phát sinh ra các rễ nhỏ (rễ phụ).
Môi trường tạo rễ cho kết quả hình thành rễ sau 4 tuần theo dõi với tỷ lệ 50,0% với sỗ rễ/cây là 2,0. Cây đu đủ in vitro có thân gầy, cuống dài, lá xanh nhạt, rễ có 1 rễ chính dài và 1 rễ phụ. Đặc điểm cây đúng với đặc điểm hình thái học của cây đu đủ đực. Như vậy bước đầu đã tạo được cây đu đủ đực hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA, α-NAA đến khả năng tạo rễ của chồi đu đủ đực (sau 4 tuần theo dõi)
Kí hiệu môi trường Nồng độ IBA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) Tỷ lệ hình thành rễ (%) Số rễ/
cây Đặc điểm chồi
ĐC 0 0 0 0 Chồi cuống ngắn, lá
vàng nhạt
R1 1 0 - 0 Thân gầy, cuống
ngắn,lá xanh nhạt R2 1,5 0 50,0 2,0 Thân gầy, cuống dài,
lá xanh nhạt R3 2 0 - 0 Cuống dài, lá vàng nhạt R4 0,5 0 0 Cuống ngắn, lá vàng nhạt R5 1,0 0 0 Cuống ngắn, lá vàng nhạt R6 2,0 0 0 Cuống ngắn, lá vàng nhạt
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Đỗ Văn Nam và cộng sự (2013), môi trường ra rễ tốt nhất là MS có bổ sung than hoạt tính và bổ sung IBA 1,5 mg/l, tỷ lệ ra rễ đạt 50% với số rễ trung bình trên một cây là 6,5 rễ [15]. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Setargie và cộng sự (2015): Môi trường cho ra rễ tốt nhất là MS có bổ sung IBA 1,5 mg/l với số rễ cao nhất là 16,25 rễ trên một cây và chiều dài rễ trung bình là 3,92 cm [55].
Đối với các nghiên cứu khác trên các đối tượng giống đu đủ khác nhau thì môi trường ra rễ phù hợp là môi trường có bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau có thể là 1, 2, 2,5 mg/l thậm chí là 3 – 4,0 mg/l. Có sự khác biệt này cũng có thể có nguyên nhân từ đối tượng mẫu ở đề tài là đu đủ đực còn các nghiên cứu khác có đối tượng là đu đủ cái và lưỡng tính hoặc cũng do giống đu đủ lựa chọn khác nhau.
Theo các nghiên cứu của Rohman và cộng sự (2007) thì môi trường ra rễ tốt nhất MS có bổ sung IBA 1 mg/l (2,18 cm trong 4 tuần) [51].Với nghiên cứu của Panjaitan và cộng sự (2007): tỷ lệ ra rễ cao nhất thu được trên môi trường MS có bổ sung IBA 1 mg/l với chiều dài rễ trung bình là 2 cm [47]. Còn nghiên cứu của Roy và cộng sự (2012) thì môi trường ra rễ phù hợp nhất MS ½ bổ sung IBA 4,0 mg/l (sau 4 tuần) số rễ trung bình là 12 đến 14 rễ trên một cây [52]. Theo Mumo (2013), môi trường có bổ sung hàm lượng IBA từ 0,1 mg/l đã có cảm ứng tạo rễ. Tỷ lệ ra rễ cao nhất trong môi trường MS bổ sung IBA 2,5 mg/l [36].
Kết luận: môi trường ra rễ phù hợp nhất là MS có bổ sung IBA 1,5 mg/l và than hoạt tính.
A B
C D Rễ
Hình 3.6. Tạo cây hoàn chỉnh
A) Chồi ban đầu trên môi trường ra rễ; B, C, D) Chôi trên môi trường R1, R2, R3 sau 4 tuần; Mũi tên chỉ rễ hình thành trên môi trường R2
Hình 3.7. Rễ cây đu đủ đực in vitro trên môi trường R2
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra quy trình nhân giống
in vitro cây đu đủ đực như sau:
Bước 1: Chọn vật liệu nuôi cấy: đoạn thân hoặc ngọn cây đu đủ đực.
Bước 2: Chế độ khử trùng mẫu cấy: HgCl2 0.15% trong 13 phút
Bước 3: Tạo mô sẹo: môi trường MS + α NAA 1,0 mg/l + BAP 0,5 mg/l
Bước 4: Tái sinh chồi từ mô sẹo: MS + α NAA 0,1 mg/l + BAP 1 mg/l
Bước 6: Tạo cây hoàn chỉnh: môi trường MS + IBA 1,5 mg/l + than hoạt tính.
Hình 3.8. Quy trình nhân giống cây đu đủ đực
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1) Đối với chế độ khử trùng mẫu cấy: chế độ khử trùng HgCl2 0,15% trong 13 phút là phù hợp để khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy (tỷ lệ mẫu sạch sống đạt 31,58 %). Vật liệu phù hợp nhất để cho hiệu quả khử trùng cao là mẫu còn non, ngọn mới phân hóa.
2) Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng đến khả năng hình thành mô sẹo: môi trường MS có bổ sung NAA 1,0 mg/l và BAP 0,5 mg/l cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất (95,4%) với mô sẹo có đặc điểm xanh nhạt, rắn, tốc độ sinh trưởng khá tốt.
3) Khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo: môi trường phù hợp cho tái sinh chồi từ mô sẹo là môi trường MS bổ sung BAP 1,0 mg/l, NAA 0,1 mg/l, tỷ lệ tái sinh chồi đạt 40,3%, với chất lượng chồi tốt, có màu xanh nhạt. Môi trường phù hợp cho nhân chồi từ mô sẹo là môi trường MS bổ sung BAP 1,0 mg/l, NAA 0,25mg/l, hệ số nhân chồi đạt 2,67 vớisố lá/ chồi 2-3 lá/chồi, chồi có màu xanh nhạt.
4) Tạo cây hoàn chỉnh: môi trường MS có bổ sung IBA 1,5 mg/l và than hoạt tính có tỷ lệ hình thành rễ tốt nhất, với số rễ/ chồi là 2. Đặc điểm rễ có 1 rễ chính dài và 1 rễ phụ.
2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để tăng hệ số nhân chồi, tạo rễ hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây đu đủ đực với các dòng đu đủ đực khác nhau để tạo nguồn dược liệu phong phú đa dạng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997),“Công nghệ tế bào thực vật trong cải tiến giống cây trồng”, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
2. Ngô Xuân Bình (2010), “Nuôi cấy mô tế bào thực vật”, NXB Khoa học và kỹ thuật.
3. Nguyễn Đức Đoàn (2005), “ Cây quả cây thuốc”, NXB Y học, tr. 30-32. 4. Hồ Thị Hà và cộng sự, (2014), “Carpainone: Alkaloid mới từ lá câu đu
đủ”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 52 (5), tr. 593-598.
5. Thái Hà, Đặng Mai (2011), “Bạn của nhà nông kỹ thuật trồng và chăm sóc cây đu đủ”, NXB Hồng Đức.
6. Trung Hiếu (2005), “Chữa bệnh bằng cây, củ, quả”, NXB Y học.
7. Nguyễn Văn Hoan, Nguyễn Tuấn Anh, Phạm Thị Ngọc (2010). “Khảo sát đặc điểm cấu tạo hoa, cụm hoa và biểu hiện kiểu hình giới tính của các mẫu giống đu đủ (Carica Papaya L.) mới thu thập”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 8(6), tr. 883 – 889.
8. Lê Văn Hoàng (2008), “Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật”,
Giáo trình, Trường đại học Đà Nẵng, Đà Nẵng.
9. Trần Bá Hoành và cộng sự (2011), “Từ điển giáo khoa Sinh học”, NXB Giáo dục Việt Nam.
10. Nguyễn Thành Hối(2000), “Kỹ thuật trồng đu đủ” , NXB Nông nghiệp, tr. 4.
11. Nguyễn Quốc Khang và Hà Thị Thanh Bình (1999), “Góp phần nghiên cứu hoạt tính sinh học của Flavonoid lá đu đủ (Carica papaya )”, Tạp chí Dược học, 6 (278), tr. 15 - 17.
12. Nguyễn Như Khanh (2011), “Giáo trình các chất điều hoà sinh trưởng thực vật”,NXB Giáo dục.
13. Đỗ Tất Lợi (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học. 14. Đoàn Lư (2015), “Rau ngon thuốc quý”, NXB Dân Trí.
15. Đỗ Văn Nam, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Bích Hồng, Phạm Thị Ngọc, Nguyễn Văn Hoan, Nguyễn Thị Phương Thảo (2013), “Nhân giống vô tính in vitro cây đu đủ Carica papaya L.”, Tạp chí Khoa học và phát triển,11(6), tr. 833-839.
16. Nguyễn Thị Nhẫn (2004), “Nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro cây đu đủ”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp,2(3), tr.174-180 17. Dương Phong (2016), “Kỹ thuật chọn giống, chăm sóc và phòng bệnh
cho cây đu đủ”, NXB Hồng Đức.
18. Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Thu Sang (2006), “Khảo sát tinh sạch Enzyme Chymopapain trong mủ trái đu đủ Việt Nam”, Tạp chí Phát triển Khoa học và công nghệ, 9(5), tr. 59-63.
19. Ngọc Phương, Hồng Hà (2009), “Đông Y trị bách bệnh”, NXB Văn hóa - thông tin.
20. Phan Đình Kim Thư, An đệ (2012), “Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất cây giống đu đủ in vitro lưỡng tính nhằm phát triển đu đủ hàng hóa chất lượng cao ở miền đông nam bộ”, Viện cây ăn quả Miền nam, Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam.
Tiếng anh
21. Ahmad N, Fazal H, Ayaz M, Abbasi B H, Mohammad I,Fazal L (2011), “Dengue fever treatment with Carica papaya leaves extracts”,Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 1(4), pp. 330-333.
22. Anjum V, Arora P, Ansari S H, Najmi A K, Ahmad S (2017), “Antithrombocytopenic and immunomodulatory potential of
metabolically characterized aqueous extract of Carica papaya leaves” Pharmaceutical Biology, 55(1), pp. 2043–2056.
23. Boomi M, Ruchi M, Shipra G, Abdul S. A, Nirmal K. L (2009), “Sperm characteristics and ultrastructure of testes of rats after long-term treatment with the methanol subfraction of Carica papaya seeds”, Asian Journal of Andrology11, pp. 583–599.
24. Chandrasekaran R , Seetharaman P , Krishnan M , Gnanasekar S, Sivaperumal S (2018), “Carica papaya (Papaya) latex: a new paradigm to combat against dengue and flariasis vectors Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae)”, 3 Biotech 8, pp. 83.
25. Chong-Pérez B, Carrasco B, Silva H, Herrera F, Quiroz K, Garcia- Gonzales R. (2018), “Regeneration of highland papaya (Vasconcelleapubescens) from anther culture”, Appl Plant Sci.,
6(9):e01182 doi: 10.1002/aps3.1182.
26. Gatambia E K, Agnes W K, Fredah K R and Monica M W (2016), “In vitro Meristem Culture for Rapid Regeneration of Papaya Plantlets in Liquid Media”, Annual Research & Review in Biology, 9(1), pp. 1-7. 27. Gheith I, El-Mahmoudy A (2018), "Novel and classical renal biomarkers
as evidence for the nephroprotective effect of Carica papaya leaf extract”, Bio Rep, 38(5), pp. 1-10.
28. Juárez-Rojop IE, Díaz-Zagoya JC, Ble-Castillo JL, MirandaOsorio PH, Castell-Rodríguez AE, Tovilla-Zárate CA, Rodríguez-Hernández A, Aguilar-Mariscal H,Ramón-Frías T, Bermúdez-Ocaña DY (2012), “Hypoglycemic effect of Carica papaya leaves in streptozotocin-induced diabetic rats”, BMC Complement Altern Med.12, pp.236.
29. Levecke B, Buttle D J, Behnke JM, Duce IR, Vercruysse1 J (2014), “Cysteine proteinases from papaya(Carica papaya) in the treatment of
experimental Trichuris suis infection in pigs: two randomized controlled trials”, Levecke et al. Parasites & Vectors 7, pp.255.
30. Mangala BM, Murthy MB, Murthy BK, Bhave S (2012), “Comparison of safety and efficacy of papaya dressing with hydrogen peroxide solution on wound bed preparation in patients with wound gape”, Indian J Pharmacol., 44(6), pp. 784–787.
31. McCubbin MJ, Staden J V, Debergh P (2003), “A modified technique for in vitro propagation of papaya (Carica papaya L.)”, South Africa Journal of Botany, 69(3), pp. 287–291.
32. Melariri P, Campbell W, Etusim P, Smith P (2011), “Antiplasmodial Properties and Bioassay-Guided Fractionation of Ethyl Acetate Extracts from Carica papaya Leaves”, Journal of Parasitology Research, Article ID 104954.
33. Mikhal'chik EV, Ivanova AV, Anurov MV, Titkova SM, Pen'kov LY, Kharaeva ZF, Korkina LG (2004), “Wound-healing effect of papaya-based preparation in experimental thermal trauma”, Bull ExpBiol Med.,137(6), pp. 560-562.
34. Mondal M, Gupta S, Mukherjee BB (1994), “Callus culture and plantlet production in carica papaya L”, Plant Cell Rep.,13(7), pp. 390- 393. 35. Moraes D, Marcelo Arantes Levenhagen MA, Costa-Cruz JM,
Costa NettoAP, Rodrigues RM (2017), "In vitro efficacy of latex and purified papain from Carica papaya against Strongyloides venezuelensis eggs and larvae", Rev Inst Med Trop Sao Paulo, PMC 5441158, PMID: 28380118.
36. Mumo N N, Rimberia F K, Mamati G E, Kihurani A W (2013), “In vitro regeneration of selected Kenyan papaya (Carica papaya L.) lines through shoot tip culture”, African Journal of Biotechnology,12(49), pp. 6826- 6832.
37. Murakami S , Eikawa S , Kaya S , IMAO M , Aji T (2016), " AntiTumor and Immunoregulatory Effects of Fermented Papaya Preparation (FPP: SAIDOPS501)", Asian Pac J Cancer Prev, 17(7): pp. 3077-84.
38. Naggayi M, Mukiibi N, Iliya E (2015), “The protective effects of aqueous extract of Carica papaya seeds in paracetamol induced nephrotoxicity in male wistar rats”, African Health Sciences, 15(2), pp. 598–605.
39. Nguyen TT, Shaw PN, Parat MO, Hewavitharana AK (2013), "Anticancer activity of Carica papaya: a review", Mol Nutr Food Res, 57(1): pp. 153-64
40. Nguyen TT, Parat M-O, Shaw PN, Hewavitharana AK, Hodson MP (2016), “Traditional Aboriginal Preparation Alters the Chemical Profile of Carica papaya Leaves and Impacts on Cytotoxicity towards Human Squamous Cell Carcinoma”, PLoS One, 11(2): e0147956.
41. Nisa F Z, Astuti M, Murdiati A, Haryana S M (2017), "Anti-proliferation and Apoptosis Induction of Aqueous Leaf Extract of Carica papaya L. on Human Breast Cancer Cells MCF-7" , Pak J Biol Sci, 20(1): pp. 36-41.
42. Ojo OA , Ojo AB , Awoyinka O , Ajiboye BO , Oyinloye BE , Osukoya OA , Olayide II , Ibitayo A (2017) "Aqueous extract of Carica papaya Linn. roots potentially attenuates arsenic induced biochemical and genotoxic effects in Wistar rats.", J Tradit Complement Med, 8(2): pp. 324-334.
43. Okoko T, Ere D (2012), “Reduction of hydrogen peroxide- induced erythrocyte damage by Carica papaya leaf extract”, Asian Pac J Trop Biomed, 2(6), pp. 449-453.
44. Otsuki N, Dang NH, Kumagai E, Kondo A, Iwata S, Morimoto C (2010), " Aqueous extract of Carica papaya leaves exhibits anti-tumor
activity and immunomodulatory effects", J Ethnopharmacol, 127(3): pp. 760-7
45. Pandey S , Cabot PJ , Shaw PN , Hewavitharana AK (2016), " Anti- inflammatory and immunomodulatory properties of Carica papaya.", J Immunotoxicol,13(4):pp. 590-602.
46. Pandey S, Walpole C,Shaw P N,Cabot P J, Hewavitharana A K,1, Batra J (2018), "Bio-Guided Fractionation of Papaya Leaf Juice for Delineating the Components Responsible for the Selective Anti- proliferative Effects on Prostate Cancer Cells", Frontiers in Pharmacology, 9: doi: 10.3389/ fphar.2018.01319.
47. Panijaitan S B, Aziz M A, Rashid A A, Saleh N M (2007), “In vitro plantlet regeneration from shoot tip of field grown Hermaphrodite Papaya (Carica papaya L. cv. Eksotika)”, Internationnal Journal of Agriculture & Biology, 09(6), pp. 827–832.
48. Pathak N , Khan S , Bhargava A , Raghuram GV , Jain D , Panwar H , Samarth RM , Jain SK , Maudar KK , Mishra DK , Mishra PK 92014), "Cancer chemopreventive effects of the flavonoid-rich fraction isolated from papaya seeds", Nutr Cancer;66(5): pp. 857-71.
49. Prado SBRD, Santos GRC, Mourão PAS, Fabi JP (2019), "Chelate- soluble pectin fraction from papaya pulp interacts with galectin-3 and inhibits colon cancer cell proliferation", Int J Biol Macromol;1(126): pp. 170-178.
50. Ranasinghe P, Ranasinghe P, Abeysekera W P K M, Premakumara G A S, Perera Y S, Gurugama P, Gunatilake S B (2012), “In vitro erythrocyte membrane stabilization properties of Carica papaya L. leaf extracts”, Pharmacognosy Res.; 4(4), pp. 196–202.
51. Rohman M M, Islam M N, Alam M S, Munshi Rashid Ahmad M S, Paul T K (2007), “Lateral Bud of Papaya (Carica papaya) for Clonal Propagation”, Biotechnology, 6(3): pp. 339-343.
52. Roy P K, Roy S K, Hakim M L (2012), "Propagation of Papaya ( Carica Papaya L.) cv. Shahi through in vitro culture", Bangladesh J. Bot, 41(2), pp. 191-195
53. Saksena P (2013), “Cell and tissue studies in papaya (Carica papaya L.)”, Nanobiotechnica Universale, 4(1&2), pp. 1-11.
54. Sekeli R, Hamid M H, Roslinda R A, Wee C, Ong-Abdullah J (2018), “Malaysian Carica papaya L. var. Eksotika: Current Research Strategies Fronting Challenges”, Frontiers in Plant Science 9, Article 1380.
55. Setargie A, Mekbib F, Abraha E (2015),“In vitro Propagation of Papaya (Carica papaya L.)”, World Journal of Agricultural Sciences, 11 (2), pp.84-88.
56. Tham C S (2013), “Morphological study of bone marrow to assess the effects of lead acetate on haemopoiesis and aplasia and the ameliorating role of Carica papaya extract” Experimental and Therapeutic Medicine 5,pp. 648-652.
57. Wu KL, Zeng SJ, Chen ZL, Duan J (2012) In vitro mass propagation of hermaphroditic Carica papaya cv. ‘Meizhonghong’. Pak J Bot, 44(5), pp.1669–1676.
PHỤ LỤC Phụ lục 1. Thành phần môi trường MS (1962)