2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.4. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11]
Nguyên lý:
Dựa vào trạng thái cân bằng bền của thuốc nhuộm Coomassie Blue G trong dung dịch, ở điều kiện axit mạnh thuốc nhuộm này tạo phức hợp màu đỏ. Khi có mặt protein, thuốc nhuộm sẽ kết hợp với protein làm cho dung dịch chuyển thành màu xanh. Mức độ đậm nhạt của màu phụ thuộc vào nồng độ protein trong dung dịch do đó có thể định lƣợng nồng độ protein bằng việc đo dộ hấp phụ của dịch màu trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 595 nm.
Các bƣớc tiến hành:
Chuẩn bị đƣờng chuẩn protein: pha BSA nồng độ 0, 10, 20, 40, 75, 100, 150 µg/ml trong nƣớc cất.
Pha loãng dung dịch Bradford 5x thành 1x, hút 0,98 ml dịch 1x vào các ống eppendorf. Bổ sung 20 µl dịch protein BSA, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Đo OD ở 595 nm trên máy đo quang phổ. Thiết lập đƣờng chuẩn bằng chƣơng trình Exel.
Pha loãng dịch protein cần đo ở các độ pha loãng khác nhau (1/10, 1/20, 1/100). Bổ sung 20 µl dịch protein mẫu ở các độ pha loãng vào 0,98 ml dịch Bradford 1x. Đo OD ở 595 nm trên máy đo quang phổ.
Chuyển đổi giá trị OD 595 sang nồng độ protein (mg/ml) theo công thức chuyển đổi.
Đồ thị đƣờng chuẩn protein có dạng nhƣ sau:
Đường chuẩn protein
y = 1.247x + 0.3831 R2 = 0.9949 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 0.05 0.1 0.15 0.2 BSA (m g/m l) O D 5 9 5 n m Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein
Công thức chuyển đổi từ giá trị OD595 sang nồng độ protein:
(y - 0,3831) a x= ---
1,247
Trong đó x là nồng độ protein (mg/ml), y là giá trị OD 595, a là số lần pha loãng mẫu.