Hình 2 .1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein
Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit
5-nitrosalicylic axit
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị cơ chất: 0,2% pectin trong đệm phản ứng: Tris 50 mM, NaCl 20 mM, CaCl2 0,1 mM pH 10.
Phản ứng enzyme:
Hút 50 µl dịch enzyme vào 350 µl dung dịch phản ứng 0,2% pectin, ủ 42oC trong 1 giờ. Mẫu đối chứng đƣợc thay dịch enzyme bằng 50µl nƣớc cất. Bổ sung 400µl DNSA, đun sôi trong 5 phút, làm nguội ở nhiệt độ phòng. Đo OD ở bƣớc sóng 530 nm.
Pha dung dịch DNSA: DNSA: 5 g; K-Na-tartarate: 150 g; NaOH 2M: 100 ml; nƣớc cất: đến 500 ml .
Xây dựng đường chuẩn glucose:
Đƣờng chuẩn glucose đƣợc thiết lập để qui đổi giá trị OD 530nm của dịch phản ứng enzyme sang đơn vị unit. Glucose đƣợc cân chính xác với độ sai số 0,0001 - 0,0005 mg, đƣợc pha loãng với các nồng độ từ 0,2 đến 20 mM trong nƣớc cất. 0,5 ml dung dịch glucose ở các nồng độ khác nhau đƣợc bổ sung 0,5 ml DNSA, đun sôi 5 phút, làm nguội tới nhiệt độ phòng sau đó đo OD trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 530 nm. Đồ thị glucose chuẩn đƣợc thiết lập trên đoạn thẳng trên phƣơng trình hồi qui bằng chƣơng trình Excel có dạng sau:
y = 0.7267x - 0.0654 R2 = 0.9981 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 1 2 3 4 5 Nồng độ glucose (mM) O D 5 3 0 n m Hình 2.3. Đƣờng chuẩn glucose
Lƣợng đƣờng khử sau phản ứng enzyme với cơ chất đƣợc tính theo công thức:
y+ 0,654 x = ---
0,7267
Trong đó: x là số mM đƣờng khử đƣợc sinh ra sau phản ứng, y là giá trị OD của phản ứng so màu ở 530 nm.
Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzyme:
Một đơn vị hoạt tính enzyme (unit) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme pectinase phân cắt cơ chất pectin tạo ra 1 µM glucose trong 1 phút.
Qui đổi từ giá trị OD 530 sang Unit đƣợc tính theo công thức sau: 1000. X
E = --- t
Trong đó: X là số mM đƣờng khử đƣợc sinh ra sau phản ứng, t là thời gian phản ứng enzyme (phút), 1000 là hệ số qui đổi mM sang µM đƣờng khử.
2.3.6. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi Nguyên lý: Nguyên lý:
Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase
Enzyme pectinase phân cắt liên kết glycosid của pectin axit bằng cơ chế chuyển liên kết tạo thành liên kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate ở đầu không khử (Hình 2.4). Liên kết đôi này có thể phát hiện trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 232 nm [28].
Các bước tiến hành:
Đệm phản ứng: Tris 50 mM, NaCl 20 mM, CaCl2 0,1 mM (pH tùy thuộc vào từng thí nghiệm).
Cơ chất pectin: 0,2% pectin axit trong đệm phản ứng. Phản ứng enzyme:
Hút 50 µl dịch enzyme vào 350 µl dung dịch cơ chất pectin, ủ 42o
C trong 1 giờ. Bổ sung 400 µl dung dịch HCl 50 mM để kết thúc phản ứng, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút sau đó đo trực tiếp trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 232 nm.
Đối chứng âm: thay dịch enzyme bằng 50 µl dH2O.
2.3.7. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B. subtilis Nguyên lý: Nguyên lý:
Để tách chiết đƣợc DNA tổng số cần phá vỡ thành tế bào, phá vỡ các liên kết của protein với DNA. Khi tách chiết cần phải làm bất hoạt các enzyme phân hủy DNA.
Các bước tiến hành:
Nuôi 1 khuẩn lạc B. subtilis trong LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37˚C qua đêm. Hút 1ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4o
C. Loại dịch trên, hòa tan tế bào vào trong 100µl TE pH 8.0. Bổ sung 10 µl lysozyme nồng độ 100 µg/ml, lắc nhẹ, ủ hỗn hợp ở 37 ˚C trong 1 giờ, sau đó bổ sung thêm 10 µl SDS 1%.
Các bƣớc tiếp theo sử dụng phƣơng pháp tách DNA bằng bộ kit tách DNA tổng số từ hãng Bioneer theo hƣớng dẫn của hãng nhƣ sau: Trộn đều 100 µl mẫu đã chuẩn bị với 500 µl dung dịch 1 (dung dịch ly giải ) (để phá vỡ tế bào), ủ hỗn hợp ở 70˚C trong 5 phút, làm mẫu nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm 600 µl chloroform, trộn đều hỗn hợp cho tới khi chuyển màu trắng sữa và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o
C.
Chuẩn bị dung dịch kết tủa DNA: pha loãng dung dịch 2 với nƣớc cất tỉ lệ 1/10: hòa 80 µl dung dịch 2 với 720 µl nƣớc cất vô trùng. Dùng pipet hút nhẹ 200 µl dung dịch DNA pha trên cùng sang ống chứa 800 µl dung dịch kết tủa DNA. Trộn đều hỗn hợp, để 1-2 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o
C. Bỏ hết dịch nổi, hòa tủa trong 150 µl dung dịch 3 (dung dịch hòa tan), trộn đều trong 10 giây đến khi hòa tan hoàn toàn tủa dƣới đáy ống. Thêm 450 µl cồn tuyệt đối, trộn đều, để hỗn hợp ở -20 ˚C trong 30 phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o
C. Bỏ dịch nổi, thêm 500 µl cồn 75%, trộn đều để rửa tủa DNA, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4o
C. Loại hết cồn và làm khô DNA, hòa tan DNA trong 100 µl dung dịch TE, bảo quản -20 ºC.
2.3.8. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli
DNA plasmid từ E. coli đƣợc tách bằng kit tách plasmid của Qiagen, các bƣớc tách chiết đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của hãng.
2.3.9. Tách chiết DNA plasmid từ B. subtilis
Cấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn trong 3 ml môi trƣờng LB + 20 g/ml kanamycine, lắc qua đêm. Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendoft, li tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch nổi, hòa tế bào lại trong 300 l dung dịch 1 (50 mM Tris-HCl; 5 mM EDTA; pH 7,5), bổ sung 5 l dung dịch RNase nồng độ 10 mg/ml và 5 l dung dịch lysozyme nồng độ 20 mg/ml (pha mới trong ngày), trộn đều, ủ 37º C trong 30 phút. Bổ sung 200 l dung dịch 2 (200 mM NaOH; 1% SDS), đảo ngƣợc ống 3-4 lần. Bổ sung 200 l dung dịch 3 (0,5 M kali acetate; pH 4,2), đảo ngƣợc ống 3-4 lần. Chiết với 0,5 ml chloroform ( lặp lại 2 lần). Tủa plasmid bằng việc bổ sung 1 ml cồn ở - 20oC qua đêm.
Sau khi tủa bằng cồn, li tâm, làm khô và hòa lại plasmid trong 50 ul TE, bảo quản trong -20oC.
2.3.10. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử
2.3.10.1. Khuếch đại gen bằng PCR
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng nhân gen Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl) dH2O vô trùng 35 Buffer 10X 5 dNTP 2mM 5 Mồi BS pel F 50 µM 1 Mồi BS pel R 50 µM 1
Dream Taq polymerase 5 u/µl 0.5
DNA khuôn mẫu: từ dịch phản ứng gắn ở mục 3 2
Tổng thể tích 50
Bảng 2.2. Chƣơng trình nhân gen bằng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94oC 2 phút
2 Biến tính 94oC 20 giây
30
3 Gắn mồi 55oC 20 giây
4 Kéo dài chuỗi 72oC 1 phút 30 giây
5 Hoàn tất 72oC 7 phút
2.3.10.2. Phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl)
dH2O vô trùng 60
Buffer 10X 10
pKTH/pUC (100 ng/µl) 30
HindIII (500 U/µl) 1
Tổng 100
Ủ 37 o
C trong thời gian 1 - 16 giờ.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl)
dH2O vô trùng 60
Buffer 10X 10
pJET/pel (100 ng/µl) 30
HindIII (500 U/µl) 1
Tổng thể tích 100
Ủ 37 o
C trong thời gian 1 - 16 giờ.
2.3.10.3. Thiết kế gen dung hợp
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl) dH2O vô trùng 10 Buffer 10X 2 pKTH-BaP 4 pel 4 T4 ligase 0.5 Tổng thể tích 20 Ủ 22 o
C trong thời gian 15 - 60 phút.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl) dH2O vô trùng 35 Buffer 10X 5 dNTP 2mM 5 Mồi 1 (50 µM) 1 Mồi 2 (50 µM) 1
Dream Taq pol (5 u/µl) 0.5 DNA khuôn mẫu: từ dịch phản ứng gắn ở Bảng 2.5 2
2.3.11. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp xung điện
Nuôi cấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5α trong môi trƣờng LB lỏng trên máy lắc 200 vòng/phút ở 37oC qua đêm. Cấy chuyển 1% dịch tế bào vào 100 ml môi trƣờng LB lỏng, lắc tiếp 220 vòng/phút ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,5 - 0,7, sau đó ủ đá trong 1 giờ. Thu dịch và ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Bổ sung nƣớc cất để rửa và ly tâm tiếp 2 lần. Hòa lại cặn trong 0,5 ml nƣớc khử ion lạnh. Chia tế bào khả biến sang ống eppendoft, mỗi ống 100 µl.
Hút 1 µl sản phẩm gắn gen vào ống eppendoft chứa tế bào khả biến, trộn nhẹ, đƣa vào cuvet xung điện. Xung điện ở điều kiện 2,5 KV, 250 F
Bổ sung 0,5 ml môi trƣờng SOC, (công thức môi trƣờng xem trong phụ lục, phần môi trƣờng). Hút dịch từ cuvert ra ống eppendoft. Lắc 220 vòng/phút, 37oC trong 1 giờ.
Trải 100 µl dịch nuôi trên môi trƣờng thạch LB có bổ sung kháng sinh ampycline 100 µg/ml, giữ trong tủ ấm 37oC qua đêm trƣớc khi kiểm tra khuẩn lạc sau biến nạp.
2.3.12. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B. subtilis 168
Plasmid pMSE3/BaP-pel đƣợc biến nạp vào B. subtilis 168 theo phƣơng pháp tế bào tƣơng hợp. Các bƣớc tiến hành cụ thể:
Nuôi 1 khuẩn lạc BS168 trên môi trƣờng SPII hoặc LB (2 ml), lắc 200 vòng/phút, 37oC, qua đêm. Cấy chuyển sang môi trƣờng SPII mới (OD khởi đầu: OD 600=0,1) (0,5 ml dịch nuôi cấy qua đêm cho vào 10 ml SPII), lắc tiếp 37oC, 3 – 4 giờ OD 600 đạt khoảng 0,6 – 0,8.
Thu tế bào: 1 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf, li tâm 5000 vòng/phút, 4 phút, loại bỏ 0,9 ml dịch nổi trên bề mặt. Bổ sung 15 µl dịch DNA (hoặc plasmid) nồng độ 2 µg/µl, lắc tiếp 30 phút, 37oC. Bổ sung 500 µl LB, lắc 1 giờ, cấy trải 50, 200 µl trên đĩa môi trƣờng chọn lọc LB + 20 µg/ml kanamycin, ủ ở 37 °C qua đêm.
Thể biến nạp thu đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc mang pMSE3/BaP-pel là chủng B. subtilis tái tổ hợp sinh pectinase sản lƣợng cao.
2.3.13. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009) [25]
Thành phần gel tách (12%)
Thành phần gel cô (5%)
15 µl dịch enzyme đƣợc bổ sung 15 µl đệm mẫu 2x. Hỗn hợp đƣợc biến tính nhiệt ở 95oC trong 5 phút, làm lạnh trong đá tan sau đó tra mẫu vào điện di trên gel polyacrylamide 12%. Sau khi kết thúc điện di, gel đƣợc nhuộm trong dung dịch nhuộm 0,1% coomassie brilliant blue 1 giờ và rửa trong đệm rửa 5% ethanol, 10% acetic acid để phát hiện băng protein.
Thành phần Nồng độ các thành phần trong gel 10ml dH2O vô trùng 3,3 30% Acrylamid 12 % 4,0 Tris-HCl 1,5M; pH 8,8 0,375 M 2,5 10% SDS 0,1 % 0,1 10% APS 0,1 % 0,1 TEMED 0,002% 0,004 Thành phần Nồng độ các thành phần trong gel 3ml dH2O vô trùng 2,1 30% Acrylamid 5 % 0,5 Tris-HCl 1M; pH 6,8 0,13 M 0,38 10% SDS 0,1 % 0,03 10% APS 0,1 % 0,03 TEMED 0,001% 0,003
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính pectinase cao pectinase cao
3.1.1. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch
Với mục đích tạo chủng biểu hiện gen pel từ B. subtilis cho công nghiệp xử lý vải bông cho nên các chủng B. subtilis đƣợc lựa chọn để sàng lọc enzyme
pel. Để chọn đƣợc các chủng B. subtilis mang gen pel, các vi khuẩn B. subtilis
mua từ bộ sƣu tập chủng giống của VTCC- Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội và Trung tâm Công nghệ sinh học phục vụ đời sống và sản xuất (Biolab) đƣợc sử dụng. Kết quả sàng lọc đƣợc thể hiện trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc các chủng B. subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch.
STT Tên chủng
Tên chủng gốc Nguồn gốc Vòng phân pectin thủy
1 VBS1 BIOLAB 1 Đất - 2 VBS2 BIOLAB 2 Đất + 3 VBS3 BIOLAB 3 Đất + 4 VBS4 BIOLAB 4 Đất + 5 VBS5 BIOLAB 5 Đất + 6 VBS6 VTCC-B-380 Đất ++ 7 VBS7 VTCC-B-1010 Đất ++ 8 VBS8 VTCC-B-818 Rễ cây ++ 9 VBS9 VTCC-B-999 Đất ++ 10 VBS10 VTCC-B-1013 Đất ++ 11 VBS11 VTCC-B-485 Đất ++ 12 VBS12 VTCC-B-732 Đất - 13 VBS13 VTCC-B-948 Rong sụn ++ 14 VBS14 VTCC-B-822 Đất ++ 15 VBS15 VTCC-B-275 Đất ++ 16 VBS16 BIOLAB 6 Đất + 17 VBS17 BIOLAB 7 Đất - 18 VBS18 BIOLAB 8 Đất + 19 VBS19 BIOLAB 9 Đất + 20 VBS20 BIOLAB 10 Đất +
Chú thích: (-) Không tạo vòng, (+) tạo vòng yếu, (++) tạo vòng mạnh với cơ chất pectin.
Các chủng vi khuẩn sau khi làm trẻ hóa trên môi trƣờng LB ở 37oC đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng LB thạch đĩa có chứa 0,2% pectin sau đó nuôi tiếp qua đêm để vi khuẩn bộc lộ khả năng sản sinh pectinase. Hoạt tính pectinase đƣợc phát hiện bằng việc nhuộm đĩa thạch với dung dịch 0,5% hecxadecyl trimethyl trimethyl trimethyl ammonium bromide (HTAB). Kết quả thể hiện cho thấy 17 chủng dƣơng tính với pectin trong tổng số 20 chủng vi khuẩn đƣợc sàng lọc (Bảng 3.1 và Hình 3.1). Điều này chứng tỏ hầu hết các chủng trong nghiên cứu đều có khả năng biểu hiện pectinase ra môi trƣờng. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây về enzyme pectinase trong B. subtilis [31], [30], [44].
Hình 3.1. Hình ảnh một số chủng B. subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2% pectin. Thứ tự các chủng từ 1-10: VBS6 đến VBS15.
3.1.2. Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu bào của các chủng nghiên cứu
Với mục đích chọn đƣợc các chủng B. subtilis sản sinh enzyme pectinase, là một enzyme pectinase thƣờng hoạt động tối ƣu ở pH kiềm, do đó chúng tôi quan tâm đến các enzyme pectinase hoạt động mạnh ở pH từ 8 – 10. Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn 9 trong 17 chủng vi khuẩn dƣơng tính mạnh với pectin trên đĩa thạch để nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng với mục đích thu enzyme pectinase ngoại bào. Môi trƣờng LB lỏng đƣợc bổ sung 0,2% pectin để kích thích sự tiết pectinase của vi khuẩn ra môi trƣờng nuôi cấy. Sau khi nuôi cấy 24
giờ ở 37oC, enzyme ngoại bào đƣợc thu nhận và sử dụng làm phản ứng với cơ chất pectin để định lƣợng hoạt tính pectinase nhƣ mô tả trong phần phƣơng pháp. Giá trị OD 530 nm thu đƣợc từ phản ứng enzyme pectinase với cơ chất pectin bằng phƣơng pháp đƣờng khử đƣợc chuyển đổi sang đơn vị Unit dựa theo đồ thị chuẩn glucose với phƣơng trình hồi qui y = 0,7267x – 0,0654, và r = 0,9981. Kết quả thu đƣợc 7 chủng có hoạt tính pectinase tối ƣu ở pH 10 và 2 chủng VBS7 và VBS10 có hoạt tính pectinase tối ƣu lần lƣợt là pH 9,5-10 và pH 8,5-10 (Bảng 3.2). Nhƣ vậy tất cả 9 chủng B. subtilis đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng đều là enzyme pectinase kiềm.
Bảng 3.2. Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ƣu của các chủng nghiên cứu chủng nghiên cứu
STT Tên chủng pH tối ƣu Hoạt tính pectinae (U/ml) 1 VBS6 10 24,7 2 VBS7 9,5 - 10 22,3 3 VBS8 10 36,5 4 VBS9 10 22,5 5 VBS10 8,5 - 10 25,5 6 VBS11 10 38,9 7 VBS13 10 30,1 8 VBS14 10 20,1 9 VBS15 10 17,5
So sánh hoạt tính pectinase của các chủng nghiên cứu ở pH tối ƣu cho thấy hoạt tính pectinase đƣợc xác định thấp nhất là chủng VBS15 (17,5 U/ml), cao nhất là chủng VBS11 (38,9 U/ml) (Hình 3.2. a, b, c). Điều này có thể giải thích rằng các chủng B. subtilis tuy cùng loài nhƣng phân lập từ các nguồn khác nhau cho nên sẽ có sự sai khác nhất định về gen dẫn đến ái lực với pectin của các enzyme này sẽ khác nhau. Vì vậy việc sàng lọc chúng để chọn đƣợc những chủng có hoạt tính pectinase cao là một tiêu chí để loại bỏ đƣợc những enzyme có hoạt tính yếu.