3.2. Tách dòng gen pectinase trong E coli
3.2.3. Tách dòng các gen pel vào E coli
Gắn pel vào pJET1.2 và biến nạp vào E. coli
Băng DNA 1,5 kb trong mục 3.2.2 đƣợc cắt ra, làm sạch bằng gel- extraction kit (Qiagen), làm tù đầu và gắn vào vector pJET1.2/blunt và biến nạp vào E. coli DH5α. Thể biến nạp đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng thạch đĩa LB chứa 100 µg/ml ampicillin ở 37 oC qua đêm.
Hình 3.5. Khuẩn lạc các thể biến nạp E. coli DH5α mang pJET/pel trên môi trƣờng chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin
Những tế bào có chứa vector nhƣng không mang đoạn gen chèn sẽ không thể sinh trƣởng đƣợc do gen gây chết (lethal gene) có trong vùng đa điểm nối (multiple cloning site) của vector gây ra. Ngƣợc lại những tế bào mang vector có đoạn gen chèn sẽ làm hỏng (knock out) gen gây chết trong vector làm cho gen
này không biểu hiện đƣợc do đó tế bào sẽ phát triển thành khuẩn lạc trên môi trƣờng chọn lọc.
Kết quả biến nạp thu đƣợc các thể biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc, điều này chứng tỏ phản ứng gắn và thí nghiệm biến nạp đã thành công (Hình 3.5).
Phân tích plasmid bằng enzyme giới hạn
Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII
1,2,: pJET1.2 mang gen pel của VBS6; 3,5: pJET1.2/pel; 4, 6: pJET1.2 mang gen pel
của VBS8, M: Marker 12 kb (Fermentas). Băng 1,5 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên. Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.
Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII
1 - 2,: pJET1.2 mang gen pel của VBS11; 3 - 4: pJET1.2 mang gen pel của VBS13, M: Marker 10 kb (Fermentas). Băng 1,5 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên. Thang DNA chuẩn
đƣợc đặt ở bên.
Các khuẩn lạc trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc nhân lên riêng rẽ trong môi trƣờng LB lỏng để tách plasmid. Plasmid sau khi tách sạch bằng kit đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn HindIII để kiểm tra đoạn gen đƣợc chèn vào hay không.
1 2 3 4 5 M 6 kb 1,5 kb 3,0 kb 1,5 kb 3,0 kb M 1 2 3 4
Do cả hai mồi dùng để nhân gen đã đƣợc treo sẵn điểm cắt HindIII ở đầu 5’ cho nên các plasmid mang gen chèn sẽ xuất hiện một băng DNA 1,5 kb và một băng vector 3 kb khi đƣợc cắt bằng HindIII.
Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid trên gel agarose cho thấy phần lớn các mẫu cắt đều có một băng vector 3 kb và 1 băng 1,5 kb đúng bằng kích thƣớc đoạn gen đƣợc nhân lên bằng PCR. Điều này chứng tỏ đoạn gen 1,5 kb nhân lên từ 4 chủng VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13 đã đƣợc chèn vào vector pJET1.2 và đƣợc nhân lên trong tế bào E. coli (Hình 3.6 và 3.7). Nhƣ vậy 4 gen pectinase từ B. subtilis nguồn gốc Việt Nam đã đƣợc tách dòng vào E. coli trong vector pJET1.2.