2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.7. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B.subtilis
Nguyên lý:
Để tách chiết đƣợc DNA tổng số cần phá vỡ thành tế bào, phá vỡ các liên kết của protein với DNA. Khi tách chiết cần phải làm bất hoạt các enzyme phân hủy DNA.
Các bước tiến hành:
Nuôi 1 khuẩn lạc B. subtilis trong LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37˚C qua đêm. Hút 1ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4o
C. Loại dịch trên, hòa tan tế bào vào trong 100µl TE pH 8.0. Bổ sung 10 µl lysozyme nồng độ 100 µg/ml, lắc nhẹ, ủ hỗn hợp ở 37 ˚C trong 1 giờ, sau đó bổ sung thêm 10 µl SDS 1%.
Các bƣớc tiếp theo sử dụng phƣơng pháp tách DNA bằng bộ kit tách DNA tổng số từ hãng Bioneer theo hƣớng dẫn của hãng nhƣ sau: Trộn đều 100 µl mẫu đã chuẩn bị với 500 µl dung dịch 1 (dung dịch ly giải ) (để phá vỡ tế bào), ủ hỗn hợp ở 70˚C trong 5 phút, làm mẫu nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm 600 µl chloroform, trộn đều hỗn hợp cho tới khi chuyển màu trắng sữa và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o
C.
Chuẩn bị dung dịch kết tủa DNA: pha loãng dung dịch 2 với nƣớc cất tỉ lệ 1/10: hòa 80 µl dung dịch 2 với 720 µl nƣớc cất vô trùng. Dùng pipet hút nhẹ 200 µl dung dịch DNA pha trên cùng sang ống chứa 800 µl dung dịch kết tủa DNA. Trộn đều hỗn hợp, để 1-2 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o
C. Bỏ hết dịch nổi, hòa tủa trong 150 µl dung dịch 3 (dung dịch hòa tan), trộn đều trong 10 giây đến khi hòa tan hoàn toàn tủa dƣới đáy ống. Thêm 450 µl cồn tuyệt đối, trộn đều, để hỗn hợp ở -20 ˚C trong 30 phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o
C. Bỏ dịch nổi, thêm 500 µl cồn 75%, trộn đều để rửa tủa DNA, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4o
C. Loại hết cồn và làm khô DNA, hòa tan DNA trong 100 µl dung dịch TE, bảo quản -20 ºC.