1 2 M
1 - 2: pMSE/BaP-pel đƣợc cắt bằng XhoI và XbaI., M : DNA marker 1 kb (EUR). Băng DNA 5,6 kb và 1,8 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên. Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.
Để đƣa gen BaP-pel vào pMSE3, trƣớc hết pMSE3 và BaP-pel sau khi nhân lên bằng PCR trong mục 3.2.3 đƣợc làm sạch bằng kit QIAGEN từ agarose sau đó xử lý với XhoI và XbaI trƣớc khi nối bằng T4 ligase ở 16 ºC qua đêm. Sản phẩm nối đƣợc biến nạp vào DH10b bằng phƣơng pháp xung điện. Thể biến nạp đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng LB thạch đĩa bổ sung 50 µg/ml kanamycin và 20 µg/ml streptomycin. Các thể biến nạp sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Kết quả trên điện di agarose cho thấy các plasmid sau khi cắt bằng XhoI và XbaI đều cho 1 băng vector kích thƣớc khoảng 5,6 kb và một băng kích thƣớc 1,8 kb (Hình 3.14). Điều này chứng tỏ gen BaP- pel đã đƣợc đƣa thành công vào vector pMSE3. Plasmid pMSE3 mang gen BaP- pel đƣợc đặt tên là pMSE/Bap-pel.
3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B. subtilis
3.3.2.1. Chuẩn bị plasmid đa copy pMSE/BaP-pel
Khác với biến nạp gen trong E. coli, biến nạp gen vào B. subtilis cần phải có lƣợng plasmid đủ lớn (30-50 µg), nồng độ plasmid phải đủ cao (khoảng 2 µg/µl) thì mới có thể biến nạp thành công. Trong thí nghiệm này, plasmid
pMSE/Ba-pel đƣợc tách sạch từ E. coli bằng kit tách plasmid của Qiagen theo hƣớng dẫn của hãng. Kết quả tách plasmid đƣợc đánh giá trên điện di agarose cho băng vector (5,6 kb ) và băng gen dung hợp BaP-pel (1,8 kb) (Hình 3.14). Điều này chứng tỏ plasmid pMSE/BaP-pel đƣợc tách sạch và đủ chất lƣợng để cho thí nghiệm biến nạp gen.
3.3.2.2. Biến nạp gen pectinase vào B. Subtilis 168
Plasmid pMSE3/BaP-pel đƣợc biến nạp vào tế bào B. subtilis 168 theo phƣơng pháp tế bào tƣơng hợp tự nhiên nhƣ mô tả trong phần phƣơng pháp. Lƣợng plasmid sử dụng để biến nạp là 5 µg trong tổng thể tích 15 µl. Sau khi kết thúc biến nạp, các thể biến nạp đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng thạch đĩa bổ sung
20 µg/ml kanamycin. Các thể biến nạp sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB lỏng bổ sung kananmycin để kiểm tra sự có mặt của plasmid trong tế bào. Các plasmid sau khi tách và phân tích bằng
XhoI và XbaI đƣợc kiểm tra trên điện di agarose. Kết quả cho thấy các plasmid tách từ các thể biến nạp khác nhau đều xuất hiện băng vector (5,6 kb) và băng gen dung hợp BaP-pel (1,8 kb) (Hình 3.15). Điều này chứng tỏ plasmid pMSE3/BaP-pel đã đƣợc biến nạp vào B. subtilis 168. Chủng tái tổ hợp này đƣợc đặt tên là BSM.