1 và 2: pMSE/BaP-pel đƣợc cắt bằng XhoI và XbaI., 3 : DNA marker 1 kb. Băng vector (5,6 kb) và BaP-pel (1,8 kb) đƣợc chỉ bằng mũi tên.
3.3.3. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng
Để đánh giá sự biểu hiện pectinase trên môi trƣờng lỏng của chủng BSM, 4 thể biến nạp khác nhau đƣợc trẻ hóa trên môi trƣờng LB lỏng 20 µg/ml kanamycin sau đó cấy chuyển sang môi trƣờng BMM (tỉ lệ 1%) để kiểm tra sự biểu hiện của gen tái tổ hợp. Sau 24 giờ nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, 37oC, enzyme ngoại bào đƣợc thu nhận bằng li tâm loại bỏ sinh khối và kiểm tra protein trên điện di SDS-PAGE cũng nhƣ khả năng phân hủy cơ chất pectin.
5,6 kb 1,8 kb
Hình 3.16. Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis tái tổ hợp đa copy trên môi trƣờng LB+Kan. 1-4: 15 µl dịch enzyme ngoại bào của các thể biến nạp khác nhau, 5: dịch lên men từ chủng B. subtilis 168.
Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy dịch enzyme của cả 4 thể biến nạp đƣợc kiểm tra đều xuất hiện 1 băng protein khá đậm kích thƣớc 42 kDa đúng với kích thƣớc của pectinase nhƣ tính toán. Mẫu đối chứng dịch enzyme từ chủng BS168 chỉ xuất hiện băng mờ, điều này chứng tỏ băng protein 42 kDa chính là pectinase tái tổ hợp đã đƣợc biểu hiện, mẫu 5 (dịch enzyme từ chủng B. subtilis
168 do pectinase đƣợc sinh ra tự nhiên nên nồng độ enzyme quá thấp cho nên không thể phát hiện đƣợc trên điện di protein (Hình 3.16).
Kiểm tra hoạt tính pectinase của các mẫu này với cơ chất pectin cho thấy hoạt tính pectinase của chủng đối chứng B. subtilis 168 chỉ đạt 15 U/ml trong khi các mẫu từ chủng tái tổ hợp đạt từ 66 - 72 U/ml (cao hơn 4,6-4,8 lần so với chủng B. subtilis 168) (Hình 3.17). 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 Hoạt tính enzym e (U/m l) BSM1 BSM2 BSM3 BSM4 BS168 Các thể biến nạp khác nhau
Hoạt tính pectate lyase của B. subtilis tái tổ hợp đa copy
Hình 3.17. Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B. subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy. BSM 1-5: các thể biến nạp
Hoạt tính pectinase của thể biến nạp cũng đƣợc kiểm tra trên đĩa thạch có 0,2% cơ chất pectin axit bằng phƣơng pháp đục lỗ. Sau khi nhỏ 30 µl dịch enzyme ngoại bào vào lỗ thạch, mẫu đƣợc ủ 42 ºC qua đêm sau đó nhuộm với ruthenium red 0,05%. Kết quả cho thấy đƣờng kính vòng hoạt tính mẫu tái tổ hợp BSM tạo ra là 3 cm, lớn hơn nhiều mẫu đối chứng B. subtilis 168 không mang gen (1,8 cm) (Hình 3.18).
Hình 3.18. Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B. subtilis 168 trên cơ chất pectin axit. BSM: thể biến nạp đa
copy, BS168: chủng B. subtilis 168 không đƣợc biến nạp gen.
Nasser và cộng sự (1993) đã biểu hiện thành công gen pel của B. subtilis
trong tế bào E. coli với hệ biểu hiện T7 promoter, tuy nhiên sản phẩm biểu hiện đã tạo ra một protein nguyên vẹn có kích thƣớc 42 kDa và một protein không nguyên vẹn kích thƣớc 33 kDa [30]. Khác với Nasser, kết quả biểu hiện gen pel
trong B. subtilis của chúng tôi chỉ cho một băng protein 42 kDa, điều này chứng tỏ gen pel đƣợc biểu hiện trong tế bào B. subtilis tốt hơn trong E. coli. Liu và cộng sự (2011) đã biểu hiện thành công gen pectinase kiềm (Apel) từ B. subtilis
TCCC11286 trong tế bào B. subtilis WB600, kết quả biểu hiện cũng chỉ cho một băng protein duy nhất 45 kDa [27] tƣơng tự nhƣ kết quả biểu hiện của chúng tôi.
3.4. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên sinh ra từ chủng tự nhiên
3.4.1. So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên pectinase từ chủng tự nhiên
Để xác định nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng, dịch enzyme thu đƣợc sau lên men chủng tái tổ hợp BSM và chủng tự nhiên VBS11 đƣợc ủ với 0,2% pectin trong đệm Tris 50 mM, 20 mM NaCl, 0,2 mM CaCl2, pH 10 ở các nhiệt độ khác nhau. Phản ứng enzyme đƣợc thực hiện nhƣ trong phần phƣơng pháp. Giá trị OD 530 thu đƣợc sau khi đo trên máy quang phổ đƣợc chuyển đổi sang đơn vị hoạt tính (Unit). 0 20 40 60 80 100 120 140 25 30 35 40 42 45 50 55 60 70 Nhiệt độ (ºC) H oạ t tí nh e nz ym e (U ) rPel VBS11
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme
Kết quả trên Hình 3.19 cho thấy nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng của rPel là 42oC, tƣơng tự nhƣ hoạt tính tối ƣu của chủng tự nhiên VBS11. Hoạt tính enzyme có xu hƣớng giảm nhanh ở các nhiệt độ phản ứng cao hơn nhiệt độ tối ƣu. Kết quả này giống với kết quả nghiên cứu trƣớc đây về nhiệt độ tối ƣu của enzyme pectinase từ B. subtilis của Nasser và cộng sự [31].
3.4.2. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên pectinase từ chủng tự nhiên 0 20 40 60 80 100 120 140 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 Giá trị pH H o ạt t ín h e n zy m e (U ) VBS11 rPel
Hình 3.20. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzyme
Tính chất xúc tác phản ứng phân cắt của enzyme đều phụ thuộc vào pH của đệm phản ứng do đó cần thiết phải đánh giá sự ảnh hƣởng của pH để tìm ra pH tối ƣu. Trong thí nghiệm này enzyme đƣợc thực hiện phản ứng với 0,2% pectin trong đệm tris 50 mM, 10 mM NaCl, 0,2 mM CaCl2 ở các pH khác nhau. Kết quả thí nghiệm cho thấy hoạt tính enzyme rPel đạt cao nhất ở pH10 (Hình 3.20). pH tối ƣu của rPel cũng tƣơng tự nhƣ pH tối ƣu của enzyme Pel từ chủng gốc VBS11 đã đƣợc trình bày trong phần 3.1. Điều này chứng tỏ tính chất xúc tác phản ứng của rPel không thay đổi so với enzyme từ chủng tự nhiên.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ 4.1. Kết luận
Đã sàng lọc đƣợc 4 chủng B. subtilis nguồn gốc Việt Nam sinh pectinase cao. Giải mã đƣợc trình tự gen của 4 gen pectinase: pel6, pel8, pel11 và pel13. Độ tƣơng đồng của 4 gen phân lập với các trình tự nucleotide với gen có độ tƣơng đồng cao là từ 96,3, tới 99,5%. Độ tƣơng đồng aa với các trình tự aa của Pel đã biết đạt 98,8 đến 99,7%.
Tạo đƣợc 01 chủng B. subtilis BSM tái tổ hợp đa copy sinh pectinase sản lƣợng cao.
Nhiệt độ và pH tối ƣu của enzyme tái tổ hợp rPel là 42 oC, pH 10.
4.2. Kiến nghị
Với kết quả nghiên cứu bƣớc đầu của đề tài đã đạt đƣợc, đề tài cần tiếp tục đƣợc nghiên cứu:
Nghiên cứu xử lý vải bông thô bằng rPel để loại pectin.
Nghiên cứu tối ƣu điều kiện lên men chủng sinh pectinase tái tổ hợp qui mô pilot.
Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ xử lý sinh học (Bioscouring) thay thế xút trong khâu nấu kiềm (alkaline scouring).
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Dƣơng Văn Tuân, Lê Thị Hoàng Linh. 2012. 'Nghiên cứu sử dụng hệ enzyme pectinase, cellulase của vi khuẩn B.subtilis, P.lantarum và nấm mốc A.niger,
Ph.chrysosporium để xử lý lớp nhớt của vỏ cà phê'. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012.
2. Huỳnh Ngọc Oanh, Trần Ngọc Hùng. 2008. 'Thu nhận enzyme pectinase từ Asp.niger
- tinh sạch bằng phƣơng pháp lọc gel và lọc màng'. Science & Technology Development, Vol 11, No.08 - 2008.
3. Nguyễn Nhật Minh Phƣơng , Chế Văn Hoàng , Lý Nguyễn Bình và Châu Trần Diễm Ái. 2011. 'Tác động enzyme pectinase đến chất lƣợng rƣợu vang xoài sau thời gian lên men chính'. Tạp chí Khoa học 2011:20a 127-136.
4. Trƣờng, L. V., Thomas, S. (2010) 'Biểu hiện cao gen mã hóa xylanase trong Bacillus subtilis sử dụng promoter alpha-amylase từ Bacillus amyloliquefaciens', Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp. 827- 832.
5. Trƣờng, L. V., Việt, H., Hải, T.N. (1998) 'Tách dòng và biểu hiện cao của gen alpha- amylase từ Bacillus amyloliquefaciens trong Bacillus subtilis', Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 36 (2), pp. 12-18.
Tài liệu tiếng Anh
6. Albersheim, P. and Killias, U. (1962) 'Studies relating to the purification and properties of pectin transeliminase', Arch Biochem Biophys, 97, pp. 107-15.
7. Angayarkanni, J., Palaniswamy, M., Murugesan, S. and Swaminathan, K. (2002) 'Improvement of tea leaves fermentation with Aspergillus spp. pectinase', J Biosci Bioeng, 94(4), pp. 299-303.
8. Anis, P. a. E., H. A. (2002) 'Comparison of alkaline scouring of cotton vs. alkaline pectinase preparation', AATCC Review, 2(12), pp. 22-28.
9. Batra, S. K. (1985) in Lewin, M., and Pearce, E.M. (ed.) Handbook of Fiber Science and Technology, pp. 727-807.
10.Bernfeld, P. (1955) 'Amylases a and b. In: Colowick SP, Kaplan NO (eds) ', Methods in enzymeology. New York, pp. 149-155.
11.Bradford, M. M. (1976) 'A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding', Anal Biochem, 72, pp. 248-54.
12.Buchert, J., and Pere. J., (2000) 'Scouring of cotton with pectinases, proteases and lipases', Textile Chemist and Colorist & American Dyestuff Reporter, 31(5), pp. 48-52. 13.Burkholder, P. R. and Giles, N. H., Jr. (1947) 'Induced biochemical mutations in
Bacillus subtilis', Am J Bot, 34(6), pp. 345-8.
14.Cavaco-Paulo, A., Gübitz, G. M. (2003) 'Textile processing with enzyme ',
Cambridge: Woodhead Publishing, pp. 17–18, 30–34, 51–52, 90–95, 110, 124–125, 129–131, 158–169.
15.Etters, J. N., Husain, P. A, N.K. Lange (1999) 'Alkaline pectinase: an ecofriendly approach to cotton preparation', Textile Asia, pp. 83-86.
16.Finkelman, M. J., J. E. Zajic (1978) 'Developments in Industrial', Microbiology, pp. 459.
17.Fu, L. L., Xu, Z.R., Li, W., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X (2007) 'Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: imrpelication for optimization of heterologous protein secretion.', Biotechnol. Adv, 25, pp. 1-12.
18.Guo, W., González-Candelas, L., Kolattukudy, P.E. (1995) 'Cloning of a novel constitutively expressed pectinase gene pelB from Fusarium solani f. sp. pisi (Nectria haematococca, mating type VI) and characterization of the gene product expressed in Pichia pastoris', J Bacteriol, 177(24), pp. 7070-7.
19.Hartzell, M. M., Hsieh, Y. L. (1998) 'Enzymeatic scouring to improve cotton fabric wettability', Text. Res. J., 68(4), pp. 233-41.
20.Kashyap, D. R., Vohra, P.K., Chopra, S., Tewari, R. (2001) 'Applications of pectinases in the commercial sector: a review', Bioresource Technology, 77, pp. 215- 227.
21.Keen, N. T. and S., T. (1986) 'Structure of two pectinase genes from Erwinia chrysanthemi EC1 and their high-level expression in Escherichia coli', J. Bacteriol. 22.Klug-Santner, B. G., Schnitzhofer, W., Vrsanská, M., Weber, J., Agrawal, P.B.,
Nierstrasz, V.A., Guebitz, G.M. (2006) 'Purification and characterization of a new bioscouring pectinase from Bacillus pumilus BK2', J Biotechnol, 121, pp. 390-401. 23.Kunst, F., et al. (1997) 'The complete genome sequence of the Gram-positive
bacterium Bacillus subtilis', Nature, 390, pp. 249-256.
24.Lei, S. P., Lin, H.C., Heffernan, L., Wilcox, G. (1985) 'Cloning of the pectinase genes from Erwinia carotovora and their expression in Escherichia coli', Gene, 35(1-2), pp. 63-70.
25.Laemmli U., K. 2009. “Clevage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”. Nature 227 (5259): 680-685.
26.Li, Y. a. H., I. R. (1998) 'Enzymatic Scouring of Cotton - Surfactants, Agitation, and Selection of Enzymes', Text. Chem. Col., 30(9), pp. 23-9.
27.Liu, Y., Chen, G., Wang, J., Hao, Y., Li, M., Li, Y., Hu, B., Lu, F. (2012) 'Efficient expression of an alkaline pectinase gene from Bacillus subtilis and the characterization of the recombinant protein', Biotechnol Lett., 34(1), pp. 109-15.
28.Macmillian, J. D., et al. (1966) Methods in enzymeology, pp. 632.
29.Morozova, V.V., Semenova, M.V., Salanovich, T.N., Okunev, O.N., Koshelev, A.V., Bubnova, T.V., Krichevskiĭ, G.E., Timatkov, A.G., Barysheva, N.V., Sinitsyn, A.P. (2006) 'Application of neutral-alkaline pectinase to cotton fabric boil off', Appl Biochem Microbiol, 42, pp. 603-8.
30.Nasser, W., Awadé, A.C., Reverchon, S., Robert-Baudouy, J. (1993) 'Pectinase from Bacillus subtilis: molecular characterization of the gene, and properties of the cloned enzyme', FEBS Lett, 335(3), pp. 319-26.
31.Nasser, W., Chalet, F., Robert-Baudouy J. (1990) 'Purification and characterization of extracellular pectinase from Bacillus subtilis', Biochimie, 72, pp. 689-695.
32.Pickersgill, R., Jenkins, J., Harris, G., Nasser, W., Robert-Baudouy, J. (1994) 'The structure of Bacillus subtilis pectinase in complex with calcium', Nature, 1(10), pp. 717 – 723.
33.Reid, I., Ricard, M. (2000) 'Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide', Enzyme Microb Technol, 26, pp. 115-23.
34.Reid, I., Ricard, M. (2004) 'Purified pectinase lowers cationic demand in peroxide- bleached mechanical pulp', Enzyme Microb Technol, 34, pp. 499-504.
35.Ricca, E., Adriano, O., Henriques and Simon M. Cutting (2004) 'Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications', Horizon Bioscience Press.
36.Schaechter, M., Ingraham, J.L., Neidhardt, F.C. (2007) 'The road from The Microbial world to Microbe', Int Microbiol, 10(3), pp. 153-6.
37.Schallmey, M., Singh, A., and Ward, O. P. (2004) 'Developments in the use of Bacillus species for industrial production', Can. J. Microbiol, 50, pp. 1-17.
38.Schols, H. A., M. A. Posthumus, Voragen, A.G.J.. (1990) 'Structural features of hairy region of pectin isolated from apple juice producted by the liquefation process',
Carbohydrate Research, 206(1), pp. 117-129.
39.Seagull, R. W., Oliveri, V., Murphy, K., Binder, A., and Kothari, S. (2000) 'Cotton fiber growth and development 2. Changes in cell diameter and wall birefringence ', J. Cotton Sci 4, pp. 97-104.
40.Searle-van Leeuwen, M. J. F., Vincken, J.P., Schipper, D., Voragen, A.G.J., Beldman, G., Voragen, J.V.a.A.G.J. (1996) 'Acetyl esterases of Aspergillus niger: purification and mode of action on pectins', Prog. Biotechnol., pp. 793–798.
41.Shevchik, V. E., J. Robert-Baudouy, Hugouvieux-Cotte-Pattat N. (1997) 'Pectinase PelI of Erwinia chrysanthemi 3937 belongs to a new family', J. Bacteriol 179, pp. 7321-7330.
42.Somogyi, M. (1952) Journal of Biological Chemistry, 195, pp. 19.
43.Sonenshein A.L., H. J., Richard Losick (2002) 'Bacillus subtilis and its closest Relatives: From Genes to Cells', ASM Press.
44.Soriano, M., Diaz, P., Pastor, F.I.J. (2006) 'Pectinolytic systems of two aerobic sporogenous bacterial strains with high activity on pectin', Curr Microbiol, 50, pp. 114-8.
45.Traore, M. K., Buschle-Diller, G. (2000) 'Environmentally Friendly Scouring Processes', TCC&ADR, 32(12), pp. 40-43.
46.Truong, L. V., Tuyen, H., Helmke, E., Binh, L.T., Schweder, T. (2001) 'Cloning of two pectinase genes from the marine Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis strain ANT/505 and characterization of the enzymes', Extremophiles, 5(1), pp. 35-44.
47.Vigneswaran, M. A., N. Anbumani (2012) 'Neural Network Approach for Optimizing the Bioscouring Performance of Organic Cotton Fabric through Aerodynamic System',
Journal of Textile and Apparel technology and Management, 7(3 ).
48.Waddell, R. B. (2002) 'Bioscouring of cotton: commercial applications of alkaline stable pectinase', AATCC Review 2, pp. 28-30.
49.Wang, L. F., and Doi, R.H. (1989) 'Heterologous gene expression in Bacillus subtilis', in Butterworth-Heinemann, R.H.D.a.M.M. (ed.) Biology of bacilli: applications to industry. Boston: Mass, pp. 63–104.
50.Whitaker, J. R. (1990) 'Microbial pectolytic enzymes', in William, M.F.a.G., T. Kelly (ed.) Microbial enzymes and biotechnology. 2 ed.
51.Wipat, A., Harwood, C. R. (1999) 'The Bacillus subtilis genome sequence: the molecular blueprint of a soil bacterium', FEMS Microbiology Ecology 28 (1 ), pp. 1-9. 52.Zhang, C., Yao, J., Zhou, C., Mao, L., Zhang, G., Ma, Y. (2013) 'The alkaline
pectinase PEL168 of Bacillus subtilis heterologously expressed in Pichia pastoris is more stable and efficient for degumming ramie fiber', BMC Biotechnology.