6. Cấu trúc của đề tài
3.1.5. Nghiên cứu về điều kiện và khả năng bảo quản của bộ kit
Tiến hành thử nghiệm độ bền của thuốc thử trong các điều kiện bảo quản như sau:
- Trong điều kiện bảo quản ở 40 C không bị tác dụng bởi ánh sáng. - Trong điều kiện bảo quản ở 40 C dưới tác dụng của ánh sáng thường. - Trong điều kiện ngoài môi trường thông thường (phòng thí nghiệm) từ tháng 02 đến tháng 8 năm 2015.
- Trong điều kiện ngoài môi trường thông thường (phòng thí nghiệm) từ tháng 02 đến tháng 8 năm 2015 nhưng được để trong hộp kín, không bị tác dụng của ánh sáng.
Bảng 3.10. Kết quả xác định độ bền thuốc thử theo thời gian bảo quản Tuần 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 ĐK1 TT TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS V V DT (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) ĐK2 TT TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS V V V V V V V DT (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) ĐK3 TT TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS V V V V V V V V VV VV VV VV VV DT (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+-) (+-) (-+) (-+) ĐK4 TT TS TS TS TS TS V V V V V V V V V VV VV VV VV VV VV VV VV VV VV VV VV VV DT (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+-) (+-) (+-) (-+) (-+) (-+) (-+) (-+)
Ghi chú:
TT: tình trạng dung dịch khi kiểm tra ; DT: Khả năng dương tính TS: dung dịch tồn tại ở dạng trong suốt
V: dung dịch đã ngả sang màu vàng nhạt VV: dung dịch đã ngả vàng
(+): dung dịch cho kết quả dương tính rõ ràng với vết máu có độ pha loãng 10.000 lần
(+-): dung dịch cho kết quả dương tính không rõ ràng với vết máu có độ pha loãng 10.000 lần.
(-+): dung dịch cho kết quả dương tính rất yếu với vết máu có độ pha loãng 10.000 lần.
ĐK 1: Trong điều kiện bảo quản: 40C không bị tác dụng bởi ánh sáng.
ĐK 2: Trong điều kiện bảo quản: 40C dưới tác dụng của ánh sáng thường.
ĐK 3: Trong điều kiện ngoài môi trường thông thường (phòng thí nghiệm từ tháng 02 đến tháng 8 năm 2015).
ĐK 4: Trong điều kiện ngoài môi trường thông thường (phòng thí nghiệm từ tháng 02 đến tháng 8 năm 2015) nhưng được để trong hộp kín, không bị tác dụng của ánh sáng.
Kết quả: Thuốc thử bảo quản tốt nhất ở 40C không bị tác dụng bởi ánh sáng.
3.1.6. Thử nghiệm với máu bị phân hủy trong điều kiện môi trƣờng
Thuốc thử sau khi pha được tiến hành thử trực tiếp với các mẫu máu đã pha loãng để ở ống eppenderf trong thời gian 2 tháng, 4 tháng và 6 tháng rồi sau đó được thấm trên que tăm bông.
Số đợt thí nghiệm là 02 lần độc lập nhau
Số mẫu thực hiện cho mỗi lần là 25 mẫu tăm bông Tổng số mẫu thực hiện N=50 mẫu
Mẫu âm tính (Negative): dung dịch NaCl 0,9%.
Mẫu dương tính (Positive): dung dịch máu người toàn phần.
Kết quả thực nghiệm: Kết quả thực nghiệm thuốc thử với máu đã bị phân hủy theo thời gian được nêu ở bảng sau:
Bảng 3.11. Kết quả thử nghiệm với máu đã bị phân hủy
Kí hiệu Độ pha loãng
Kết quả (%) dương tính với máu sau 2 tháng ở điều kiện
thường
Kết quả (%) dương tính với máu sau 4
tháng ở điều kiện thường
Kết quả (%) dương tính với máu sau 6 tháng ở
điều kiện thường
1 1/2 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 2 1/4 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 3 1/8 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 4 1/16 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 5 1/32 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 6 1/64 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 7 1/128 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 8 1/256 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 9 1/512 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 10 1/1024 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 11 1/2048 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 12 1/4096 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 13 1/8192 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 14 1/16384 50/50 (100%) 47/50 (94%) 45/50 (90%) 15 1/32768 45/50 (90%) 37/50 (74%) 34/50 (68%) 16 1/65536 42/50 (84%) 26/50 (52%) 21/50 (42%) 17 1/131072 25/50 (50%) 13/50 (84%) 10/50 (20%) 18 1/262144 7/50 (14%) 2/50 (4%) 2/50 (4%) 19 1/524288 0/50 (0%) 0/50 (0%) 0/50 (0%) 20 1/1048576 0/50 (0%) 0/50 (0%) 0/50 (0%) Negative 0 0/50 (0%) 0/50 (0%) 0/50 (0%) Positive 1 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%)
Kết quả thử với dung dịch máu pha loãng để ở các điều kiện sau 2 tháng thể hiện ở hình đại diện sau:
Hình 1. Kết quả thử với dung dịch máu pha loãng để ở các điều kiện sau 2 tháng
Kết luận: dựa vào các thử nghiệm tiến hành, có thể thấy, khả năng phát hiện dấu vết máu của thuốc thử bị giảm đi 1 bậc từ khả năng phát hiện với máu có độ pha loãng 1/131.072 xuống còn 1/65.536 với máu dung dịch sau 2 tháng và khả năng phát hiện tiếp tục giảm đi với máu sau 4 và 6 tháng thuốc thử chỉ có khả năng phát hiện với máu có độ pha loãng 1/32.768 lần.
3.2. So sánh độ nhạy của thuốc thử đối với các phƣơng pháp phân tích dấu vết máu hiện có
3.2.1. Với kháng huyết thanh kháng protein người
Chúng tôi đã sử dụng phương pháp khuếch tán miễn dịch kép (theo Ouchternoly) xác định độ nhạy với máu pha loãng dùng trong đề tài với kháng protein huyết thanh do Viện Khoa học hình sự cung cấp, kết quả được thể hiện trong hình sau:
Hình 2. Kết quả xác định độ nhạy của máu pha loãng với kháng huyết thanh kháng protein người
Kết quả xác định chính xác protein loài theo phương pháp Ochternoly cho thấy: Nồng độ pha loãng tối đa vẫn cho kết quả dương tính quan sát được bằng mắt thường là ở nồng độ pha loãng tối đa là 1/8.192.
3.2.2. Với kít định lượng ADN người (Human Quantifiler) do Applybiosystems (Mỹ) sản xuất Applybiosystems (Mỹ) sản xuất
Sử dụng máu pha loãng dùng trong đề tài để xác định nồng độ ADN người với kít định lượng ADN người (Human Quantifiler)
Kết quả được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.12. Xác định hàm lượng ADN người ở các nồng độ pha loãng máu khác nhau
Độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 Nồng độ ADN 11,1 5,6 2,7 0,9 0,5 0,3 0,1 0,006 0,003 0,001 0,0001
3.7.3. Với kít truy nguyên cá thể người Identifiler do Applybiosystems (Mỹ) sản xuất[14] (Mỹ) sản xuất[14]
Tương tự, chúng tôi đã xác định độ nhạy với máu pha loãng dùng trong đề tài với kít truy nguyên cá thể người đang được sử dụng phổ biến trên thế
giới và Việt Nam, kết quả cho thấy kít truy nguyên cá thể chỉ xác định được kiểu gen với nồng độ pha loãng máu tối đa là 1/2048 lần.
Bảng 3.13. Bảng tổng hợp kết quả so sánh độ nhạy của thuốc thử phenolphthalein đối với các phương pháp phân tích dấu vết máu hiện có
Độ pha loãng máu Dương tính với dung dịch phenolphthalein Dương tính kháng huyết thanh người Nồng độ AND (ng/µl) Mức độ xác định kiểu gen 1/2 + + 11,1 Đầy đủ 1/4 + + 5,6 Đầy đủ 1/8 + + 2,7 Đầy đủ 1/16 + + 0,9 Đầy đủ 1/32 + + 0,5 Đầy đủ 1/64 + + 0,3 Đầy đủ 1/128 + + 0,1 Đầy đủ 1/256 + + 0,006 Đầy đủ 1/512 + + 0,003 Đầy đủ 1/1024 + + 0,001 Một số 1/2048 + + 0,0001 Một vài 1/4096 + + 0 Không 1/8192 + + 0 Không 1/16384 + - 0 Không 1/32768 + - 0 Không 1/65536 + - 0 Không 1/131072 + - 0 Không 1/262144 - - 0 Không 1/524288 - - 0 Không 1/1048576 - - 0 Không 1/2097152 - - 0 Không
3.3. So sánh độ nhạy của thuốc thử phenolphthalein với các phương pháp thử định hướng khác phương pháp thử định hướng khác
3.3.1. So sánh với phương pháp benzidine truyền thống
Chúng tôi đã tiến hành so sánh độ nhạy của thuốc thử với các kít thử định hướng dấu vết máu bằng benzidine và các kít thử định hướng của các hãng khác trên thế giới: [16]
Hình 3. So sánh trực tiếp giữa thuốc thử định hướng phenolphthalein và dung dịch benzidine truyền thống
Ghi chú:
Tăm bông bên phải: thuốc thử định hướng Benzidine cho kết quả màu xanh.
Tăm bông bên trái: thuốc thử định hướng phenophthalein cho kết quả màu hồng.
15: độ pha loãng 1 trong 32.768 16: độ pha loãng 1 trong 65.536 17: độ pha loãng 1 trong 131072
3.3.2. So sánh với kít phenolphthalein của hãng Medtech (Đức)
Hình 4. So sánh với kít phenolphthalein của hãng Medtech (Đức)
Với kít thử Phenolphthalein Presumptive Blood kit do hang Medtech, phản ứng có kết quả dương tính với mức pha loãng máu tối đa là 1/262.144 lần, thuốc thử phenolphthalein của đề tài cũng có độ nhạy tương đương.
3.3.3. So sánh với kít Hemastix của hãng Roche
Hình 5. So sánh với kít Hemastix của hãng Roche
Độ nhạy của kít thử định hướng dấu vết máu Hemastix là 1/2.097.152 cao hơn so với kít thử định hướng của đề tài (kít thử định hướng của đề tài là
THẢO LUẬN
Dựa vào đặc tính của Phenolphthalein và từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đã đưa ra quy trình pha chế và sử dụng thuốc thử phenolphthalein cho giám định định hướng dấu vết máu như sau:
1. Quy trình pha chế
- Dung dịch gốc:
Pha dung dịch KOH 25%
Cân 25g KOH, bổ sung dI H2O đến 100ml Bổ sung 10g bột kẽm (Zn) vào dung dịch Bổ sung 2g phenolphthalein
Đun sôi hỗn hợp trên trong thời gian 120 phút (dung dịch chuyển hết sang trạng thái không màu, trong suốt).
Lọc hỗn hợp trên bằng giấy lọc Bổ sung 0.25g bột kẽm
Bảo quản dung dịch trong lọ thủy tinh tối màu ở điều kiện 4oC. - Dung dịch hoạt động
Pha dung dịch gốc với ethanol 95% ở tỉ lệ 1:1 Bảo quản ở nhiệt độ 40C trong điều kiện tối. Cơ chất cho quá trình phản ứng là H2O2 3%
Với máu dấu vết ở trạng thái khô, dùng dung dịch Ethanol 95% để làm ướt dấu vết.
2. Quy trình sử dụng bộ kít thƣơng phẩm
- Dùng bông hay tăm bông thấm ẩm nước cất, lau nhẹ để tách một phần nhỏ dấu vết cần thử định hướng.
- Nhỏ một giọt dung dịch Alcohol (dung dịch 1) vào dấu vết và đợi khoảng 40 giây, nhỏ tiếp một giọt dung dịch đổi màu (dung dịch 2), sau đó nhỏ một giọt H2O2 3% (dung dịch 3) vào dấu vết và đọc kết quả.
- Đánh giá kết quả:
+ Dương tính: cho kết quả màu hồng + Âm tính: không đổi màu
Phản ứng chỉ đọc kết quả trong vòng 1 phút.
Bảng 3.14. Kết quả tổng hợp so sánh độ nhạy của phản ứng đối với các kít thử định hướng thương mại
STT Độ pha Độ pha loãng Dương tính phenol Dương tính benzidine Dương tính metech Dương tính Hemastix 1 1/2 + + + + 2 1/4 + + + + 3 1/8 + + + + 4 1/16 + + + + 5 1/32 + + + + 6 1/64 + + + + 7 1/128 + + + + 8 1/256 + + + + 9 1/512 + + + + 10 1/1024 + + + + 11 1/2048 + + + + 12 1/4096 + + + + 13 1/8192 + + + + 14 1/16384 + + + + 15 1/32768 + + + + 16 1/65536 + - + + 17 1/131072 + - + + 18 1/262144 - - - + 19 1/524288 - - - + 20 1/1048576 - - - + 21 1/2097152 - - - + 22 1/4194304 - - - -
3. Đánh giá triển khai ở các địa phương
Từ kết quả nghiên cứu đạt được, chúng tôi tiến hành thử nghiệm dung dịch phenolphthalein dưới dạng bộ kít và gửi về một số địa phương để kiểm nghiệm, đánh giá chất lượng, có 07 đơn vị gửi đánh giá về một số tiêu chí sau:
+ Chất lượng của bộ kít + Thao tác sử dụng + Độ nhạy
+ Khả năng triển khai trong giám định và khám nghiệm hiện trường. Các địa phương đã gửi kết quả nhận xét:
- Phòng KTHS Công an TP Hải Phòng - Phòng KTHS Công an tỉnh Vĩnh Phúc - Phòng KTHS Công an tỉnh Bắc Giang - Phòng KTHS Công an tỉnh Thanh Hóa - Phòng KTHS Công an Thừa Thiên Huế - Phòng KTHS Công an TP Hồ Chí Minh - Phân Viện KHHS tại TP Hồ Chí Minh
Bảng 3.15. Tổng hợp kết quả nhận xét của các địa phương. Đánh giá
Tiêu chí Rất tốt Tốt Đạt Không đạt
Chất lượng của bộ kít 4/7 2/7 1/7 -
Thao tác sử dụng - 6/7 - 1/7
Độ nhạy 3/7 4/7 - -
Khả năng triển khai trong khám nghiệm hiện trường
Hiện tại có trên 30 đơn vị là các phòng Kỹ thuật hình sự Công an các địa phương đề nghị đưa dung dịch thuốc thử phenolphthalein vào sản xuất thành các bộ kít để cung cấp cho các địa phương nhằm thay thế thuốc thử dấu vết máu bằng dung dịch Benzidine.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Đã xác định được hóa chất chuyển đổi phenolphthalein từ trạng thái oxy hóa sang dạng khử là kim loại kẽm (Zn), quá trình chuyển đổi diễn ra ở nhiệt độ sôi của dung dịch.
Đã tối ưu và đưa ra được quy trình chuẩn dùng để pha chế thuốc thử định hướng và xây dựng các bước hướng dẫn sử dụng thuốc thử định hướng dấu vết máu.
Đã xác định được độ nhạy của phản ứng đối với dung dịch máu pha loãng tới 1/65.536 lần vẫn cho kết quả dương tính đạt tới tỉ lệ 98%. Với máu sau 2 tháng độ nhạy giảm xuống chỉ còn khả năng dương tính với tỉ lệ 84% và sau 4 tháng, 6 tháng tỉ lệ này lần lượt là 52% và 42%.
Khả năng dương tính giả của thuốc thử: chỉ dương tính với nhóm nhựa thuộc họ cải trong những nhóm chất tiến hành thử nghiệm.
Độ nhạy của thuốc thử nhạy hơn so với thuốc thử bằng dung dịch benzidine (dung dịch benzidine có độ nhạy với máu toàn phần pha loãng 1/32.768).
Thuốc thử định hướng dấu vết máu sử dụng phenolphthalein đã đáp ứng đầy đủ những tiêu chí trong giám định dấu vết máu, như:
- Có tính đặc hiệu cao với dấu vết máu.
- Có độ nhạy đảm bảo các tiêu chuẩn của giám định sinh học pháp lý. - Được sử dụng rộng rãi trên thế giới.
- Có độc tính thấp.
- Dễ tìm kiếm sử dụng và bảo quản.
2. Kiến nghị:
Sau khi thực hiện đề tài, chúng tôi có một số kiến nghị như sau:
Phương pháp giám định định hướng bằng kít phenolphthalein có thể thay thế phương pháp giám định định hướng dấu vết máu sử dụng benzidine vì những lợi ích về môi trường, sức khỏe cán bộ chiến sỹ và đặc biệt là gia tăng độ nhạy, độ tiện dụng của phương pháp tránh sai sót trong quá trình khám nghiệm hiện trường và giám định dấu vết máu.
Tiếp tục nghiên cứu để tạo ra bộ kít hoàn chỉnh và tiến tới nghiên cứu để tạo ra bộ kít ở dạng khô, tương tự như kít Hemastic trên thị trường phục vụ tốt hơn cho công tác giám định và khám nghiệm hiện trường dấu vết máu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. PGS.TS. Ngô Tiến Quý, Hà Quốc Khanh, TS. Nguyễn Văn Hà, và cộng sự, Giám định sinh học pháp lý. Giáo trình. Viện khoa ho ̣c hình sự, 2005. 2. Hà Quốc Khanh, TS. Nguyễn Văn Hà (2007), Giám định ADN, Giáo
trình, Viê ̣n khoa ho ̣c hình sự.
3. PGS.TS. Ngô Tiến Quý (2008), Bảo vệ và khám nghiệm hiện trường, NXB Công an Nhân dân.
4. Ths. Phạm Xuân Thủy, CN. Hà Quốc Khanh (2010), Dấu vết sinh vật và
pháp y hình sự, Giáo trình, Học viện Cảnh sát Nhân dân.
5. PGS.TS. Ngô Tiến Quý (2013), Phát hiện, thu, bảo quản, nghiên cứu và
giám định dấu vết sinh học, NXB Công an Nhân dân.
6. Bạch Quốc Tuyên và cộng sự (1974), Huyết học, tập 1, NXB Y học, Hà Nội. 7. Vũ Triệu An, Lê Đức Cư, Văn Đình Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh, Đỗ Trung
Phấn, Phạm Hoàng Phiệt (1982), Những kỹ thuật cơ bản trong miễn dịch học, tập 1 và 2, NXB Y học, Hà Nội.
Tiếng anh
8. Budowle B, Leggitt JL, Defenbaugh DA, Keys KM, Malkiewicz SF. The presumptive reagent fluorescein for detection of dilute bloodstains and
subsequent STR typing of recovered DNA. J Forensic Sci 2000;45:1090-2.
9. Butler J.M (2001), Forensic DNA: biology adn technology behind STR
marker. Academic Press, London.
10.Butler J.M., Ruitberg C.M. and Reeder D.J (1997), Proceedings of the
Eighth Internationnal Symposium on Human Identification. Madison WI:
Promega corporation, pp73-88.