6. Cấu trúc của đề tài
2.3.4. Sử dụng kỹ thuật PCR bằng bộ kít AmpFlSTR Identifier PCR
Amplification Kit để nhân bội ADN từ các dấu vết máu đã được thử bằng phenolphthalein
Sau khi mẫu ADN được định lượng, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các mẫu bằng bộ kít AmpFlSTR Identifier PCR Amplification Kit.
Thành phần của mỗi một phản ứng gồm có:
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR sử dụng kít Identifiler
Thành phần Thể tích
AmpFlSTR PCR Reaction Mix 5,25 µl
AmpliTaq Gold ADN Polymarase 0,25 µl
AmpFlSTR Identifiler Primer Set 2,75 µl
Mẫu -
Nước -
Tổng 12,5 µl
Hỗn hợp phản ứng được chạy trên máy PCR 9700 với chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt được sử dụng cho phản ứng nhân gen
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95oC 11 phút 1 chu kỳ 94oC 1 phút 28 chu kỳ 59oC 1 phút 72oC 1 phút 60oC 60 phút 1 chu kỳ 4oC ∞ 1 chu kỳ
Sử dụng phản ứng nhân gen PCR để tạo lập các bản sao của các vùng ADN dựa vào các mồi đã được xác định từ trước.Trong các ứng dụng hình sự, ứng dụng lượng hữu hạn các khu vực đa hình của bộ genome, những vùng này mang thông tin để có thể nhận dạng cá thể từ các mẫu sinh học cần giám định.
Những vùng này có thể bao gồm những trình tự đa dạng khác nhau.. Những vùng này sau đó có thể sẽ được khuếch đại và sự đa dạng trong các sản phẩm đã được khuếch đại sẽ được nhận biết qua quá trình phân tách dựa vào trọng lượng phân tử trong quá trình điện di. STR (short tandem repeat) bản chất là kỹ thuật sử dụng đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại, các đoạn này có tâm là những đoạn lặp từ 2 đến 6 base pairs. Nhìn chung, sử dụng các STR có lợi điểm so với các VNTR đó là có thể khuếch đại từ những lượng mẫu đã bị phân hủy, thường có ít đột biến hơn. Trong khi có nhiều locus với đoạn lặp đôi (2 nucleotide), những đoạn này có nhiều nhược điểm hơn so với các locus có đoạn lặp 3 hay 4 nucleotide (tri-, tetra-nucleotide). Các đoạn lặp đôi thường có tỷ lệ đột biến cao hơn, có độ nhiễu (sttuter) cao hơn và khó phân tách các alen hơn trong quá trình phân tích. Có khoảng 400000 các đoạn lặp STR ba hoặc tư nucleotide trong toàn bộ genome người trong đó khoảng 50% là có sự đa hình.