6. Cấu trúc của đề tài
1.4.3. Cách tiếp cận phương pháp thử định hướng dấu vết máu
Do chi phí cho việc phân tích ADN cao nên trước khi gửi bất kỳ mẫu nào để các phòng thí nghiệm giám định ADN, cần xác định xem những mẫu đó là máu người hay không. Điều này được thực hiện bằng cách thử định hướng dấu vết máu. Để chủ động trong công tác giám định định hướng dấu vết máu về phương tiện kỹ thuật đặc biệt là hóa chất tiêu hao hàng ngày ở đơn vị PC54 các tỉnh thành phố là rất quan trọng trong công tác chiến đấu, phòng chống tội phạm, do đó nhu cầu về một phương pháp thử định hướng dấu vết máu thay thế phương pháp hiện tại là rất cấp bách.
Với mong muốn tự chủ trong công tác giám định và dựa trên những tài liệu đã thu thập được về việc sử dụng phương pháp thử định hướng dấu vết máu bằng phenolphthalein trong y học và trong hình sự, đề tài nghiên cứu thử nghiệm so sánh phương pháp thử định hướng dấu vết máu bằng dung dịch phenolphthalein với phương pháp sử dụng Benzidin truyền thống, để có cơ sở khoa học đưa ra quy trình pha chế sử dụng, đánh giá và chịu trách nhiệm về quy trình pha chế, vì tính đặc thù trong công tác giám định pháp lí.
Hạn chế của phương pháp giám định định hướng đang sử dụng tại Viện Khoa học hình sự và PC54 Công an các tỉnh thành phố là sử dụng Benzidin rất độc hại, là chất gây ung thư, khó phân hủy trong môi trường tự nhiên và những hóa chất này không mang tính phổ biến tại thị trường Việt Nam (giá thành của 25 gram benzidin khoảng 18 triệu đồng).
Việc tìm ta một phương pháp giám định định hướng khác nhằm khắc phục những hạn chế của các phương pháp như trên sẽ bảo vệ sức khỏe các cán bộ làm công tác giám định, chủ động hóa chất tại các đơn vị chiến đấu một cách thường xuyên, đặc biệt là bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng, tiết kiệm chi phí cho công tác giám định.
Trên cơ sở tổng quan lý thuyết của phản ứng hiện màu của Phenolphthalein, nguyên lý của phương pháp này dựa trên hoạt tính perosidase của nhân hem trong hồng cầu của máu với cơ chất là H2O2. Khi gặp máu thì thuốc thử từ dạng khử chuyển sang dạng oxi hóa và xuất hiện màu đặc trưng trong môi trường kiềm. Đề tài tiến hành nghiên cứu thử nghiệm, tìm ra nồng độ tối ưu của thuốc thử và các chất tham gia vào quá trình phản ứng.
Cuối cùng sẽ đánh giá và đưa ra những ưu điểm và nhược điểm của phương pháp, sau đó chuyển về các địa phương ứng dụng để tiếp tục thử
nghiệm song song 2 phương pháp (cùng với phương pháp sử dụng Benzidin). Kết quả của thử nghiệm sẽ được đánh giá lại để có cơ sở hoàn thiện việc pha chế và xây dựng bộ kít cùng quy trình thử nghiệm đưa vào sử dụng chính thức trong giám định dấu vết máu tại các tỉnh thành phố trong cả nước.
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
2.1.1. Hóa chất
Các loại hóa chất là cơ chất của thuốc thử: benzidine, phenolphthalein, O-toludine.
Một số kít thử định hướng dấu vết máu hiện bán trên thế giới.
Các loại bột kim loại: bột đồng (Cu), bột kẽm (Zn), bột thiếc (Sn), bột mangan (Mn), bột sắt (Fe)
Các hóa chất tạo dung môi: NaOH, KOH, ethanol, methanol, axit axetic, H2O2, HCL, ether ethylic, NaCl, H2 SO4
Chelex® 100 Resin(Bio- rad, Mỹ)
Kít định lượng AND QuantifilerTM Human DNA Quantification. Kít AmpF1STR Identifiler PCR Amplification kit.
Kháng huyết thanh kháng protein người (Viện Khoa học hình sự - Bộ công an sản xuất).
2.1.2. Thiết bị
- Máy ly tâm (Mikro 200 – Hittich/Đức) - Máy PCR 9700 (ABI – Mỹ)
- Tủ hút
- Buồng thao tác - Blook gia nhiệt
- Máy khuấy từ gia nhiệt
- Máy điện di mao quản Sequencer ABI – 3130
2.1.3. Dụng cụ
- Pipet các loại
- Ống Eppendorf các loại - Plate 96 giếng
- Đầu côn các loại
- Lọ thủy tinh, bình đun sôi, phễu, đũa thủy tinh - Găng tay cao su
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp pha loãng máu người toàn phần
Máu người toàn phần được pha loãng theo nguyên tắc bước sau pha loãng gấp hai lần bước trước.
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ pha loãng máu từ máu toàn phần
Bảng 2.1. Độ pha loãng máu và mật độ hồng cầu trung bình
STT Độ pha loãng Mật độ hồng cầu/1µl (trung bình)
1 1/2 2.000.000 2 1/4 1.000.000 3 1/8 500.000 4 1/16 250.000 5 1/32 125.000 6 1/64 62.500 7 1/128 31.250 8 1/256 15.625
9 1/512 7.813 10 1/1024 3.906 11 1/2048 1.953 12 1/4096 977 13 1/8192 488 14 1/16384 244 15 1/32768 122 16 1/65536 61 17 1/131072 31 18 1/262144 15 19 1/524288 8 20 1/1048576 4 21 1/2097152 2 22 1/4194304 1 23 1/8388608 0 24 1/16777216 0 2.2.2. Các phương pháp tiến hành
2.2.2.1. Xác định hóa chất chuyển đổi phenolphthalein từ dạng oxi hóa sang dạng khử
Tiến hành thử nghiệm bằng các kim loại như Cu, Mn, Zn, Fe có khả năng kết hợp với oxy trong môi trường kiềm mạnh là NaOH và KOH. Thử trực tiếp ở các nồng độ phenolphthalein 0,5%, 1%, 2%, 3% và 4% trong dung dịch kiềm các nồng độ 10%, 15%, 20%, 25% và 30%.
2.2.2.2. Xác định nồng độ hóa chất tối ưu cho dung dịch thuốc thử
Tiến hành pha 100ml dung dịch thuốc thử gốc.
- Bổ sung thêm 10 gam bột kẽm (Zn) vào dung dịch, đun sôi cho đến khi dung dịch trong suốt (dung dịch sẽ chuyển từ dung dịch có màu đỏ tía sang trạng thái không màu trong quá trình đun sôi).
- Tiến hành lọc dung dịch bằng giấy lọc. - Thêm 100ml ethanol vào dung dịch.
2.2.2.3. Xác định độ nhạy của dung dịch thuốc thử phenolphthalein
Thao tác thực hiện: Thuốc thử sau khi pha được tiến hành thử trực tiếp với các mẫu máu đã pha loãng (dung dịc máu pha loãng được thấm trên que tăm bông).
2.2.2.4. Xác định sự dương tính giả của thuốc thử đối với những chất không phải là máu
Tiến hành thử nghiệm thuốc thử đã được pha với các nhóm hóa chất sau: - Nhóm các chất tẩy rửa gia dụng
- Nhóm chất nhựa thực vật
- Nhóm hóa chất tổng hợp có màu đỏ - Máu của một số loài động vật
2.2.2.5. Nghiên cứu về điều kiện và khả năng bảo quản của bộ kít
Tiến hành thử nghiệm độ bền của thuốc thử trong các điều kiện nhiệt độ, ánh sáng và thời gian.
- Dung dịch thuốc thử của đề tài sau khi pha được cất trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C không bị tác dụng của ánh sáng và tiến hành để thuốc thử sau khi pha ở nhiệt độ 40C có ánh sáng thường chiếu vào.
- Dung dịch thuốc thử của đề tài sau khi pha được để trong đĩa lõm để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và dung dịch thuốc thử của đề tài được đóng kín trong lọ cũng tiến hành để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
2.2.2.6. Thử nghiệm với máu bị phân hủy trong điều kiện môi trường
Thuốc thử sau khi pha được tiến hành thử trực tiếp với các mẫu máu đã pha loãng để ở ống eppenderf trong thời gian 2 tháng, 4 tháng và 6 tháng.
2.2.2.7. So sánh độ nhạy của thuốc thử với các phương pháp phân tích dấu vết máu hiện có
- Với kháng huyết thanh kháng protein người.
- Với kít định lượng ADN người (Human Quantifiler) do Applybiosystems (Mỹ) sản xuất.
- Với kít truy nguyên cá thể người Identifiler do Applybiosystems (Mỹ) sản xuất
- So sánh độ nhạy của kít với các phương pháp thử định hướng khác: + So sánh với phương pháp benzidine truyền thống
+ So sánh với kít phenolphthalein của hãng Medtech (Mỹ) + So sánh với kít Hemastix của hãng Roche.
2.3. Các phương pháp nghiên cứu bổ trợ
2.3.1. Phương pháp xác định máu loài theo Ochternoly. [6][7]
Phương pháp thường được áp dụng để xác định định tính đặc hiệu loài là phản ứng khuyếch tán miễn dịch kép theo phương pháp của Ochternoly để xác định protein đặc hiệu loài trong dấu vết máu. Để thực hiện phản ứng này phải có các loại kháng huyết thanh (kháng thể) đặc hiệu có hiệu giá ngưng kết cao, chủ yếu là kháng huyết thanh người. Khi thực hiện phản ứng phải chú ý đến lượng kháng thể và kháng nguyên sao cho tương đương nhau để cho phản ứng thực hiện được tối ưu, cho kết quả rõ ràng, dễ quan sát.
Để thực hiện phản ứng này sử dụng agarose có nồng độ từ 1-1,5%, hệ đệm pH 8,0-8,4, quá trình tiến hành bắt buộc phải có kháng huyết thanh người và một số loài động vật.
Trong huyết thanh, trong các dịch cơ thể đều có chứa các kháng nguyên đặc hiệu loài. Khi các kháng nguyên này kết hợp với các kháng thể đặc hiệu sẽ tạo thành dạng kết tủa, nhìn thấy được.
Phương pháp xác định tính đặc hiêu loài bằng kỹ thuật Ochternoly không chỉ áp dụng cho dấu vết máu mà còn được áp dụng cho cả dấu vết là chất bài tiết, chất tiết, mô tế bào...
2.3.2. Phương pháp tách DNA bằng Chelex®[17]
ADN được tách chiết theo quy trình chuẩn bằng phương pháp vô cơ sử dụng hạt chelex (quy trình đã được phòng thí nghiệm ADN hình sự của cảnh sát bang Victoria - Liên bang Úc phê chuẩn).
Chelex® 100 Resin có khả năng loại bỏ các chất ức chế kim loại mà không làm thay đổi nồng độ các ion không kim loại của dung dịch tinh sạch. Resin được tạo thành bởi hai polymer styrene và divinylbenzene chứa các liên kết imino, vì vậy có khả năng bám các kim loại cao. Nó là hợp chất trùng ngưng stirene divinylbenzene có chứa các cặp ion imminodiaxetat hoạt động là nhóm tạo phức. Sự có mặt của chelex ở nhiệt độ 1000
C sẽ ngăn cản sự biến tính của ADN vì nó gắn được với các ion kim loại đa hóa trị như magnesium (Mg++). Nhờ việc loại bỏ Mg++ ra khỏi phản ứng thì các enzym phân hủy ADN (nuclease) sẽ bị bất hoạt và nhờ vậy các phân tử ADN được bảo vệ.
Phương pháp tách ADN bằng chelex 100 đơn giản, cho hiệu quả cao và có thể áp dụng với nhiều đối tượng mẫu khác nhau. Chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết ADN bằng chelex 100 để tách ADN từ các mẫu máu đã được pha loãng.
Quy trình tách chiết bằng chelex gồm các bước sau:[2][5]
- Bước 1: Dùng nước, PBS hoặc dung dịch tách chiết với mục đích chính để tác tế bào có nhân ra khỏi vật mang và loại bỏ bớt những tạp chất không phải là ADN.
- Bước 2: Dùng chelex (thường là chelex 5%) ở 560C để phá vỡ màng tế bào, phân hủy protein, giải phóng ADN.
- Bước 3: Xử lý ở 1000C để phá hủy hoàn toàn protein và giải phóng ADN ra khỏi nhân.
- Bước 4: Ly tâm để tách ADN ra khỏi dung dịch chelex, bảo quản ở - 40
C.
Phương pháp tách chiết bằng chelex là phương pháp vô cơ, có ưu điểm thao tác đơn giản, ít bị nhiễm và tốn ít thời gian. ADN được tách chiết theo phương pháp này rất phù hợp cho phản ứng PCR vì đã loại bỏ được các chất ức chế phản ứng PCR.
2.3.3. Phương pháp định lượng DNA bằng kit QuantifilerTM Human DNA Quantification.[20] DNA Quantification.[20]
Nguyên lý: Dựa vào quá trình lai đầu dò có gắn biotin với ADN cần định lượng đã được cố định trên màng nilon. Đầu dò này đặc hiệu với đoạn lặp của locus D17Z1. Gắn enzym HRP-SA (horseradish peroxidase streptavidin, là loạienzym liên kết) vào đầu kia của biotin trên đầu dò. Enzym này xúc tác quá trình oxy hóa của chromgen TMB (Tetrametilbenzidine) và tạo ra các kết tủa màu xanh (blue) trên màng nilon. Lượng ADN của mẫu được đánh giá dựa vào độ màu (đậm, nhạt) của các kết tủa so sánh với độ màu của lượng ADN trong thang chuẩn.
Phương pháp dùng bộ kít định lượng là phương pháp định lượng chính xác, nhanh chóng và đặc hiệu với ADN người, ngay cả với những mẫu có hàm lượng ADN thấp.
Chuẩn bị hóa chất, kít, bổ sung ADN cần định lượng theo quy định của nhà sản xuất. Các bước tiến hành:
-Bước 1: Chuẩn bị mẫu
+ Ngâm màng với dung dịch làm ướt màng từ 1-30 phút.
+ Cho dung dịch spottinh vào các ống định lượng; Thêm vào mỗi ống lượng ADN chuẩn hoặc ADN mẫu.
+ Chuyển các mẫu đã được chuẩn bị từ ống nghiệm vào màng. Hút chân không cho tới khi toàn bộ mẫu được bám trên màng.
-Bước 2:
+ Chuyển màng vào khay lai với dung dịch lai ở 37-500C; thêm H2O2 30%; lắc 15 phút trong nồi cách thủy ở 500C; đổ bỏ dung dịch.
+ Cho dung dịch lai và đầu dò vào khay. Lắc 30 phút trong nồi cách thủy ở 500C; đổ bỏ dung dịch.
+ Cho dung dịch rửa ở 37-500C; Lắc vài giây và đổ bỏ dung dịch.
+ Cho dung dịch rửa ở 37-500C và enzym vào khay, lắc 10 phút trong nồi cách thủy ở 500C; đổ bỏ dung dịch.
+ Cho dung dịch rửa ở 37-500C; lắc 1 phút trên máy lắc, đổ bỏ dung dịch; lặp lại 2 lần.
+ Cho dung dịch rửa ở 37-500C; lắc 15 phút trên máy lắc, đổ bỏ dung dịch. + Ngâm màng trong đệm citrate ở nhiệt độ phòng trong vài giây; đổ bỏ dung dịch.
-Bước 3: Hiện màu
+ Chuyển màng sang khay hiện màu; thêm đệm citrate; chromegen TMB và H2O2 3%; lắc 30 phút trên máy lắc, đổ bỏ dung dịch.
+ Rửa màng bằng nước cất trong 3 lần.
-Bước 4: Đánh giá kết quả: so sánh vạch mầu giữa ADN mẫu và ADN chuẩn.
* Phương pháp định lượng bằng thiết bị Realtime PCR: đây là phương pháp thực hiện kỹ thuật PCR nhờ có thiết bị Realtime PCR với hệ thống nhận biết sản phẩm sau mỗi chu kỳ PCR bằng cách kích hoạt chất phát quang trong sản phẩm PCR. Độ phát quang đậm nhạt của sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ sẽ được máy ghi lại và dùng hàm log tự động so sánh với thang ADN định lượng chuẩn đã được chạy và nhập sẵn vào máy trước đó ở dạng đồ thị.
2.3.4. Sử dụng kỹ thuật PCR bằng bộ kít AmpFlSTR Identifier PCR Amplification Kit để nhân bội ADN từ các dấu vết máu đã được thử bằng Amplification Kit để nhân bội ADN từ các dấu vết máu đã được thử bằng phenolphthalein
Sau khi mẫu ADN được định lượng, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các mẫu bằng bộ kít AmpFlSTR Identifier PCR Amplification Kit.
Thành phần của mỗi một phản ứng gồm có:
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR sử dụng kít Identifiler
Thành phần Thể tích
AmpFlSTR PCR Reaction Mix 5,25 µl
AmpliTaq Gold ADN Polymarase 0,25 µl
AmpFlSTR Identifiler Primer Set 2,75 µl
Mẫu -
Nước -
Tổng 12,5 µl
Hỗn hợp phản ứng được chạy trên máy PCR 9700 với chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt được sử dụng cho phản ứng nhân gen
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95oC 11 phút 1 chu kỳ 94oC 1 phút 28 chu kỳ 59oC 1 phút 72oC 1 phút 60oC 60 phút 1 chu kỳ 4oC ∞ 1 chu kỳ
Sử dụng phản ứng nhân gen PCR để tạo lập các bản sao của các vùng ADN dựa vào các mồi đã được xác định từ trước.Trong các ứng dụng hình sự, ứng dụng lượng hữu hạn các khu vực đa hình của bộ genome, những vùng này mang thông tin để có thể nhận dạng cá thể từ các mẫu sinh học cần giám định.
Những vùng này có thể bao gồm những trình tự đa dạng khác nhau.. Những vùng này sau đó có thể sẽ được khuếch đại và sự đa dạng trong các sản phẩm đã được khuếch đại sẽ được nhận biết qua quá trình phân tách dựa vào trọng lượng phân tử trong quá trình điện di. STR (short tandem repeat) bản chất là kỹ thuật sử dụng đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại, các đoạn này có tâm là những đoạn lặp từ 2 đến 6 base pairs. Nhìn chung, sử dụng các STR có lợi điểm so với các VNTR đó là có thể khuếch đại từ những