6. Cấu trúc của đề tài
2.3.3. Phương pháp định lượng DNA bằng kit QuantifilerTM
DNA Quantification.[20]
Nguyên lý: Dựa vào quá trình lai đầu dò có gắn biotin với ADN cần định lượng đã được cố định trên màng nilon. Đầu dò này đặc hiệu với đoạn lặp của locus D17Z1. Gắn enzym HRP-SA (horseradish peroxidase streptavidin, là loạienzym liên kết) vào đầu kia của biotin trên đầu dò. Enzym này xúc tác quá trình oxy hóa của chromgen TMB (Tetrametilbenzidine) và tạo ra các kết tủa màu xanh (blue) trên màng nilon. Lượng ADN của mẫu được đánh giá dựa vào độ màu (đậm, nhạt) của các kết tủa so sánh với độ màu của lượng ADN trong thang chuẩn.
Phương pháp dùng bộ kít định lượng là phương pháp định lượng chính xác, nhanh chóng và đặc hiệu với ADN người, ngay cả với những mẫu có hàm lượng ADN thấp.
Chuẩn bị hóa chất, kít, bổ sung ADN cần định lượng theo quy định của nhà sản xuất. Các bước tiến hành:
-Bước 1: Chuẩn bị mẫu
+ Ngâm màng với dung dịch làm ướt màng từ 1-30 phút.
+ Cho dung dịch spottinh vào các ống định lượng; Thêm vào mỗi ống lượng ADN chuẩn hoặc ADN mẫu.
+ Chuyển các mẫu đã được chuẩn bị từ ống nghiệm vào màng. Hút chân không cho tới khi toàn bộ mẫu được bám trên màng.
-Bước 2:
+ Chuyển màng vào khay lai với dung dịch lai ở 37-500C; thêm H2O2 30%; lắc 15 phút trong nồi cách thủy ở 500C; đổ bỏ dung dịch.
+ Cho dung dịch lai và đầu dò vào khay. Lắc 30 phút trong nồi cách thủy ở 500C; đổ bỏ dung dịch.
+ Cho dung dịch rửa ở 37-500C; Lắc vài giây và đổ bỏ dung dịch.
+ Cho dung dịch rửa ở 37-500C và enzym vào khay, lắc 10 phút trong nồi cách thủy ở 500C; đổ bỏ dung dịch.
+ Cho dung dịch rửa ở 37-500C; lắc 1 phút trên máy lắc, đổ bỏ dung dịch; lặp lại 2 lần.
+ Cho dung dịch rửa ở 37-500C; lắc 15 phút trên máy lắc, đổ bỏ dung dịch. + Ngâm màng trong đệm citrate ở nhiệt độ phòng trong vài giây; đổ bỏ dung dịch.
-Bước 3: Hiện màu
+ Chuyển màng sang khay hiện màu; thêm đệm citrate; chromegen TMB và H2O2 3%; lắc 30 phút trên máy lắc, đổ bỏ dung dịch.
+ Rửa màng bằng nước cất trong 3 lần.
-Bước 4: Đánh giá kết quả: so sánh vạch mầu giữa ADN mẫu và ADN chuẩn.
* Phương pháp định lượng bằng thiết bị Realtime PCR: đây là phương pháp thực hiện kỹ thuật PCR nhờ có thiết bị Realtime PCR với hệ thống nhận biết sản phẩm sau mỗi chu kỳ PCR bằng cách kích hoạt chất phát quang trong sản phẩm PCR. Độ phát quang đậm nhạt của sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ sẽ được máy ghi lại và dùng hàm log tự động so sánh với thang ADN định lượng chuẩn đã được chạy và nhập sẵn vào máy trước đó ở dạng đồ thị.