6. Cấu trúc của đề tài
2.3.5. Phương pháp điện di huỳnh quang
Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành xác định kiểu gen của các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp điện di huỳnh quang (hay còn gọi là điện di mao quản) trên máy giải trình tự gen ABI 3130 của hãng Applied Biosystems.
Phương pháp điện di huỳnh quang (hay còn gọi là điện di mao quản). Các cặp mồi được đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau vì vậy sau quá trình PCR sẽ tạo ra các locus được gắn các chất nhuộm huỳnh
quang tương ứng. Các locus này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang. Màu xanh (blue), xanh lá cây (green), vàng (yellow), đỏ (red) và cam (orange) tương ứng với các dye 6-FAM, VIC, NED, PET và LIZ. Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng của chất nhuộm màu huỳnh quang. Các hạt huỳnh quang hấp thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn). Một màng lọc sáng được sử dụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó.
Sau quá trình điện di, các kết quả thu được được xử lý bằng phần mềm để xác định các alen của mỗi locus.
- Các bước tiến hành điện di:
+ Chuẩn bị mẫu trước khi điện di: Ngoài các mẫu là đối tượng nghiên cứu, chúng tôi chuẩn bị thêm hỗn hợp phản ứng cho thang alen chuẩn. Thành phần và tỷ lệ thể tích từng hỗn hợp phản ứng cho mẫu hoặc thang alen như sau:
Bảng 2.4. Thành phần của hỗn hợp điện di trên máy AB 3130
Thành phần Thể tích
Hi-DiTM Formamide 8,7 µl GeneScan™ 500 LIZ® 0,3 µl Mẫu (Thang alen) 1,5 µl
Tổng 10,5 µl
Hỗn hợp phản ứng được biến tính trên máy PCR 9700 ở 95oC trong vòng 4 – 5 phút, sau đó lấy ra và ủ ngay vào đá lạnh trong 3 phút. Quá trình biến tính và làm lạnh đột ngột này đảm bảo hầu hết ADN từ dạng mạch đôi sẽ chuyển hoàn toàn sang dạng mạch đơn.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Kết quả nghiên cứu