6. Cấu trúc của đề tài
2.3.2. Phương pháp tách DNA bằng Chelex®
ADN được tách chiết theo quy trình chuẩn bằng phương pháp vô cơ sử dụng hạt chelex (quy trình đã được phòng thí nghiệm ADN hình sự của cảnh sát bang Victoria - Liên bang Úc phê chuẩn).
Chelex® 100 Resin có khả năng loại bỏ các chất ức chế kim loại mà không làm thay đổi nồng độ các ion không kim loại của dung dịch tinh sạch. Resin được tạo thành bởi hai polymer styrene và divinylbenzene chứa các liên kết imino, vì vậy có khả năng bám các kim loại cao. Nó là hợp chất trùng ngưng stirene divinylbenzene có chứa các cặp ion imminodiaxetat hoạt động là nhóm tạo phức. Sự có mặt của chelex ở nhiệt độ 1000
C sẽ ngăn cản sự biến tính của ADN vì nó gắn được với các ion kim loại đa hóa trị như magnesium (Mg++). Nhờ việc loại bỏ Mg++ ra khỏi phản ứng thì các enzym phân hủy ADN (nuclease) sẽ bị bất hoạt và nhờ vậy các phân tử ADN được bảo vệ.
Phương pháp tách ADN bằng chelex 100 đơn giản, cho hiệu quả cao và có thể áp dụng với nhiều đối tượng mẫu khác nhau. Chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết ADN bằng chelex 100 để tách ADN từ các mẫu máu đã được pha loãng.
Quy trình tách chiết bằng chelex gồm các bước sau:[2][5]
- Bước 1: Dùng nước, PBS hoặc dung dịch tách chiết với mục đích chính để tác tế bào có nhân ra khỏi vật mang và loại bỏ bớt những tạp chất không phải là ADN.
- Bước 2: Dùng chelex (thường là chelex 5%) ở 560C để phá vỡ màng tế bào, phân hủy protein, giải phóng ADN.
- Bước 3: Xử lý ở 1000C để phá hủy hoàn toàn protein và giải phóng ADN ra khỏi nhân.
- Bước 4: Ly tâm để tách ADN ra khỏi dung dịch chelex, bảo quản ở - 40
C.
Phương pháp tách chiết bằng chelex là phương pháp vô cơ, có ưu điểm thao tác đơn giản, ít bị nhiễm và tốn ít thời gian. ADN được tách chiết theo phương pháp này rất phù hợp cho phản ứng PCR vì đã loại bỏ được các chất ức chế phản ứng PCR.