4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3.1. Phương pháp thu thập số liệu
Để thu thập các số liệu liên quan đến đề tài nghiên cứu tôi đã sử dụng một số phương pháp như sau
2.3.1.1. Phương pháp kế thừa
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã đã kế thừa một số tài liệu nghiên cứu như điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội của địa phương nghiên cứu; cùng với các tài liệu tham khảo có liên quan đến vấn đề nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước.
2.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu điểm phân bố, độ gặp, điều tra môi trường sống
Để nghiên cứu điểm phân bố, độ gặp và môi trường sống của các loài nghiên cứu tôi đã sử dụng phương pháp điều tra theo ô tiêu chuẩn (OTC).
Tại thực địa, chúng tôi lập tuyến điều tra theo phương pháp của Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) và Hoàng Chung (2006). Căn cứ vào địa hình cụ thể của khu vực nghiên cứu lập các tuyến điều tra. Tuyến điều tra có hướng vuông góc hoặc song song với đường đồng mức, khoảng cách giữa các tuyến điều tra là 50-100m tùy vào loại hình cụ thể của từng quần xã. Dọc tuyến điều tra bố trí các ô tiêu chuẩn (OTC) để thu thập số liệu về mật độ, định vị tọa độ các loài bằng máy GPS, ghi chép số liệu.
Diện tích OTC: Với cây bụi như Stixis fasciculata G. (Trứng cuốc),
Capparis trinervia H. (Dùi trống) diện tích ô tiêu chuẩn là 16m2 (4m x 4m), với cây thảo gồm Cleome rutidosperma DC. (Màn màn tím), Cleome viscosa L. (Màn màn vàng) diện tích là 1m2 (1m x1m). Trong mỗi OTC chúng tôi tiến hành đếm số cây để lấy số liệu đánh giá mật độ của các loài nghiên cứu.
Các nhân tố điều tra như điều kiện môi trường sống, dạng sống, đặc điểm hình thái ngoài thực địa... được đo đếm theo quy trình điều tra rừng và lâm học nhằm đảm bảo mức độ tin cậy của các số liệu thu thập được.
Sau khi thu thập số liệu nghiên cứu ngoài thực địa, chúng tôi tiến hành thu thập mẫu các loài nghiên cứu về rễ, thân, lá, hoa, quả (nếu có) để tiếp tục các bước nghiên cứu tiếp theo.
2.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu
Ngoài thực địa, chúng tôi tiến hành quan sát, mô tả hình thái, chụp ảnh các loài cây nghiên cứu.
Phương pháp làm tiêu bản hiển vi
Giải phẫu hoa: Dùng kính lúp, kim nhọn, panh kẹp để tách thành phần của hoa, ghi chép, mô tả, đo, đếm số lượng.
Giải phẫu rễ, thân, gân lá: Dùng dao lam cắt thật mỏng theo chiều ngang. Sau đó tiến hành phương pháp nhuộm kép để nghiên cứu cấu tạo giải phẫu từ ngoài vào trong.
Phương pháp đo đếm, chụp ảnh kính hiển vi
Đo kích thước và chụp ảnh các thành phần trên kính kiển vi kết nối máy vi tính bằng phần mềm chuyên dụng ở độ bội giác khác nhau.
- Sử dụng thuật ngữ để mô tả hình thái cấu tạo giải phẫu theo Nguyễn Bá (1974 - 1975), Hình thái thực vật học tập 1,2 [1]; Hoàng Thị Sản (1980), Hình thái giải phẫu thực vật, Nxb Giáo dục; Theo Giải phẫu thực vật của Etherine Esau, Nxb khoa học kỹ thuật 1971.
2.3.1.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn
- Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu.
Nguyên liệu lá cây Trứng cuốc; lá cây Dùi trống; rễ, thân, lá cây Màn màn tím; rễ, thân, lá cây Màn màn vàng sau khi thu hái được rửa sạch, để ráo nước sau đó đem sấy khô ở 900C đến khối lượng không đổi.
- Nguyên liệu sau khi sấy khô được nghiền trong máy xay đa năng loại nhỏ thành bột dạng mịn, bảo quản nơi khô ráo để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
- Bước 2: Tạo cao chiết
Nguyên liệu được tách chiết theo phương pháp ngâm nóng. Nguyên liệu dạng bột khô được đem đi chiết với tỷ lệ 20g/100ml bằng dung môi methanol, sau đó cho vào máy lắc với tần số 200 vòng/phút (để các chất có hoạt tính sinh học tan đều trong dung môi) ở các điều kiện thời gian khác nhau (24h, 48h, 72h), sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc, 80ml dịch lọc được đem đi cô đặc bằng máy cô quay (hoặc sấy khô) đến khi có khối lượng khô không đổi và được bảo quản ở 40C để sử dụng trong các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn.
- Bước 3: Chuẩn bị giống vi khuẩn
Sử dụng 4 chủng vi khuẩn gồm 2 chủng gram dương là S.a
(Staphylococcus aureus), B.s (Bacillus subtilis); và 2 chủng gram âm là P.a (Pseudomonas aeruginosa), E.coli (Escherichia coli), lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên. Bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng: vi sinh vật được hoạt hóa trong môi trường LB, sau đó được cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, nuôi 24 giờ ở 370C, giữ trong tủ lạnh để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyển giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ 2 tuần một lần.
- Bước 4: Thử khả năng kháng khuẩn
Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của các loại dịch chiết bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
Pha các cao chiết của lá cây Dùi trống, lá cây Trứng cuốc, toàn thân cây Màn màn tím và Màn màn vàng với metanol nồng độ 10g/100ml và 5g/100ml sau đó dùng cao đã pha để thử hoạt tính kháng khuẩn.
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Khi mật độ vi khuẩn đạt đến nồng độ 108 tế bào/ml, lắc đều ống nghiệm chứa vi khuẩn. Môi trường
LB đã được hóa lỏng trong lò vi sóng, khi còn lỏng đổ đều môi trường vào các đĩa Petri, sau đó để nguội để môi trường đông đặc lại tạo thành mặt phẳng. Dùng micropipet hút 100μl dịch vi khuẩn vào giữa đĩa thạch chứa môi trường LB (Thành phần của môi trường LB là như sau (g/l): Peptone - 10; Cao nấm men - 5; NaCl -10; pH: 7,0), dùng que cấy tam giác trang đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục giếng trên môi trường thạch với đường kính 6mm, đục 5 giếng, mỗi giếng cách nhau 2-3cm. Mỗi giếng thạch nhỏ 100μl các dịch chiết cần nghiên cứu bằng micropipet, sử dụng đối chứng là dung môi metanol hoặc etanol tùy mục đích so sánh, để các đĩa thạch trong tủ lạnh 30 phút để dịch chiết khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm 370C, sau 24h mang ra đo kích thước vòng kháng khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng cách đo kích thước vùng kháng khuẩn (BK) bằng công thức: BK=D-d, trong đó D là đường kính vòng kháng khuẩn, d là đường kính giếng thạch.
2.3.1.5. Phương pháp nhân giống vô tính Phương pháp nghiên cứu chung
Bố trí thí nghiệm theo phương pháp sinh thái thực nghiệm, lặp lại 5 lần, mỗi lần lặp lại với dung lượng mẫu lớn (n ≥30).
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Để nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước hom và độ tuổi hom đến khả năng nhân giống chúng tôi tiến hành cắt các hom giống có chiều dài 5, 10, 20 cm và được chia làm ba độ tuổi khác nhau: Hom non, hom bánh tẻ và hom già. Thí nghiệm được tiến hành vào tháng 3 đến tháng 5 năm 2016 trên giá thể là cát sạch trộn trấu hun + đất đồi, được tưới ẩm hàng ngày và che sáng 75% khi trời có nắng.
Để giữ gìn nguồn giống Trứng cuốc, Dùi trống và phát triển trên quy mô rộng thì việc nghiên cứu tạo nguồn giống nhanh, nhiều và rẻ đóng vai trò quan trọng. Do vậy, đề tài tiến hành thử nghiệm với một số chất điều hòa sinh trưởng nhằm nghiên cứu khả năng ra rễ nhanh, với tỷ lệ sống cao của cành giâm. Chất điều hòa sinh trưởng dùng trong các thí nghiệm là IBA, chia theo các nồng độ 100ppm, 200ppm và 300ppm. Lô đối chứng không xử lý chất điều hòa sinh trưởng. Các hom giống được xử lý ngâm 2-3cm trong dung dịch chất điều hòa sinh trưởng trong 10 phút, để khô mặt cắt trước khi giâm. Thí nghiệm được kế thừa các kết quả trước với hom giâm bánh tẻ, dài 10cm, giá thể là cát sạch trộn trấu hun + đất đồi và tiến hành vào mùa thu.