Tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, TS. Phan Thị Phƣơng Hoa và cộng sự đã sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn đang đƣợc lƣu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) và tìm đƣợc 167 chủng đƣợc lựa chọn với khả năng kháng cao nhất cả hai chủng kiểm định Micrococcus luteus NBRC 13867 và
Escherichia coli NBRC 14237 [23]. Các chủng xạ khuẩn này đƣợc tiếp tục sàng lọc khả năng kháng 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (Xoo) R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 và R10 do PGS. TS. Phan Hữu Tôn (Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội) và cộng sự phân lập. Trong số 167 chủng xạ khuẩn này, 17 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng cả 10 chủng Xoo. Để nghiên cứu khả năng kháng đặc hiệu đối với Xoo của các 17 chủng xạ khuẩn, các
chủng vi sinh vật Bacillus subtilis NBRC 3134, Saccharomyces cerevisiae NBRC 10217, Azotobacter sp. VTCC - B - 106 và Pseudomonas putida VTCC - B - 657 đƣợc sử dụng. 5 chủng VN06 - A -353, VN08 - A - 306, VN08 - A - 352, VTCC - A - 99, VN10 - A - 44 và VN08 - A12 có tính đặc hiệu cao với Xoo, chúng chỉ ức chế một loại vi sinh vật kiểm định. Trong số đó, chủng VN08 - A12 sinh trƣởng tốt nhất và không gây ức chế những vi sinh vật có lợi nhƣ Azotobacter sp. (VTCC - B - 106) và Pseudomonas putida (VTCC - B - 657). Những thử nghiệm ngoài đồng ruộng trên 2 giống lúa Oryza sativa L. SS1 và Oryza sativa L. KD18 cho thấy dịch nuôi cấy của chủng VN08 - A12 làm giảm đáng kể tổn thƣơng do Xoo gây ra trên lá lúa [23]. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại và phân tích hoạt chất kháng Xoo do chủng VN08- A12 sinh ra.
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất
2.1.1 Nguyên liệu2.1.1.1. Các chủng Xoo 2.1.1.1. Các chủng Xoo
10 chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa ở miền Bắc Việt Nam đã nhận đƣợc từ PGS. TS. Phan Hữu Tôn và cộng sự (trƣờng Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội). Danh sách và nơi phân bố của 10 chủng vi khuẩn Xoo trên đƣợc trình bày trong bảng 3 và hình 6.
Bảng 3. Danh sách 10 chủng Xoo phân lập đƣợc ở miền Bắc Việt Nam đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
STT Chủng Phân lập từ giống lúa Địa điểm thu thập
1 R1 Khang dân, Bắc thơm 7 Bắc Ninh, Hà Nội
2 R2 Nếp tân, HT1 Sơn La, Hải Dƣơng
3 R3 Nhị ƣu 838, Hƣơng cốm Nghệ An, Thái Bình
4 R4 Thục Hƣng Thái Bình
5 R5 Khang dân, Bắc thơm Nghệ An, Hải Dƣơng
6 R6 Nhị ƣu 383 Yên Bái
7 R7 Q5, Nàng hƣơng Hải Dƣơng, Thái Bình
8 R8 Nếp thơm Hải Dƣơng
9 R9 Q5 Hải Dƣơng
Hình 6. Bản đồ phân bố của 10 chủng Xoo ở miền Bắc Việt Nam đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
2.1.1.2. Các chủng xạ khuẩn
Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 đƣợc phân lập năm 2008 hiện đang đƣợc lƣu giữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật học (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
2.1.1.3. Vi sinh vật kiểm định
Sáu chủng vi sinh vật kiểm định đƣợc sử dụng hiện đang đƣợc bảo quản tại VTCC bao gồm:
- Pseudomonas putida (VTCC - B - 657) - Saccharomyces cerevisiae (VTCC - Y - 62) - Bacillus subtilis (VTCC - B - 888)
- Azotobacter sp. (VTCC - B - 106) - Fusarium oxysporum (ATCC - 7601) - Staphylococcus aureus (ATCC - 29923)
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất 2.1.2.1. Hóa chất
- Các loại đƣờng chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose ... đƣợc mua từ hãng Merck (Đức).
- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4. 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4. 7H2O, (NH4)2SO4, CaCO3, MnCl2, Na2CO3, ZnCl2, ZnSO4 ... đƣợc nhập từ các hãng của Trung Quốc.
- Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone... của hãng Merck (Đức).
- Các loại hóa chất khác nhƣ thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose) đƣợc sản xuất ở Nhật, Trung Quốc, Việt Nam.
- Các dung môi nhƣ ethanol, iso - propanol, methanol, acetone, ethylacetate đƣợc mua từ hãng Fisher (Mỹ).
2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức) - Kính hiển vi điện tử Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan) - Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini - Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy cất nƣớc Hamilton. - Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam.
2.1.2.3. Môi trƣờng nghiên cứu
Môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn:
+ Môi trƣờng 2M (g/ l): tinh bột - 20, bột đậu tƣơng - 15, cao nấm men - 2, CaCO3 - 4, pH 6.2
+ Môi trƣờng No. 8(g/ l): casitone - 7.5, cao nấm men - 7.5, glycerol - 15, NaCl - 2.5
+ Môi trƣờng 301 (g/ l): tinh bột - 24, glucose - 1, peptone - 3, cao thịt - 3, cao nấm men - 5, CaCO3 - 4, pH 7.0
+ Môi trƣờng A - 3M g/l): glucose - 5, glycerol - 20, tinh bột - 20, pharmamedia - 15, cao nấm men - 3, Diaion HP - 20 - 10, pH 7,0
+ Môi trƣờng A - 16 (g/ l): glucose - 20, pharmamedia - 10, CaCO3 - 5
+ Môi trƣờng SKS (g/ l): tinh bột - 10, glucose - 10, bột đậu tƣơng - 10, peptone - 5, CaCO3 - 3
+ Môi trƣờng YS (g/l): cao nấm men - 2, tinh bột - 10, thạch - 16
Môi trƣờng thử hoạt tính kháng vi khuẩn:
+ Môi trƣờng PSA (g/ l): Khoai tây - 300, Na2HPO4 - 2, Ca(NO3)2 - 0.5, pepton - 5, sucrose - 15, thạch - 16, pH 7,0
+ Môi trƣờng YM (g/ l): Glucoza - 10, pepton - 5, cao nấm men - 3, cao malt - 3, thạch - 15
+ Môi trƣờng thạch thƣờng (g/ l): Pepton - 5, cao thịt - 2, NaCl - 1, thạch - 15, pH – 7,0
+ Môi trƣờng Muller - Hinton (g/l): Cao thịt - 3 ; casein thuỷ phân – 17,5; tinh bột tan – 1,5; thạch 17; pH 7,4 + 0,2.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật
2.2.1.1. Phương pháp thỏi thạch
Vi sinh vật kiểm định đƣợc nuôi trên môi trƣờng Muller - Hinton, PSA, YM, hoặc thạch thƣờng. Dịch nuôi vi sinh vật kiểm định (1 - 5 ml/ l) đƣợc thêm vào môi trƣờng đã khử trùng và để nguội đến 40 - 45C và đổ ra đĩa petri. Sau đó các thỏi thạch có xạ khuẩn đƣợc đặt lên đĩa, ủ ở 30oC trong 24 giờ. Hoạt tính kháng vi sinh vật đƣợc đánh giá bằng khả năng tạo vòng ức chế xung quanh thỏi thạch theo công thức D - d (D: đƣờng kính vòng kháng trên đĩa thạch, d: đƣờng kính của lỗ đục) (mm).
2.2.1.2. Phương pháp đục lỗ thạch
Môi trƣờng chứa vi sinh vật kiểm định đƣợc chuẩn bị nhƣ trong phƣơng pháp thỏi thạch. Sau đó, 4 - 5 lỗ trên đĩa thạch đƣợc tạo bằng khoan đục lỗ. 100 µl dịch nuôi hoặc mẫu đƣợc nhỏ vào mỗi lỗ, ủ ở 30oC trong 24 giờ. Khả năng ức chế đƣợc đánh giá bằng khả năng tạo vòng ức chế xung quanh lỗ, theo công thức D - d (mm).
2.2.2. Phân loại bằng đặc điểm hình thái
2.2.2.1. Hình thái khuẩn lạc
Hình thái khuẩn lạc xạ khuẩn đƣợc xác định về kích thƣớc, bề mặt khuẩn lạc, màu sắc của hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất bằng cách cấy ria 3 pha các chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng (ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 và YS), ủ ở 30oC trong 7 - 14 ngày.
2.2.2.2. Hình thái chuỗi sinh bào tử và bề mặt bào tử
Hình thái chuỗi sinh bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học sử dụng phương pháp cắm lamen nghiêng 45oC trên đĩa thạch YS đã cấy chủng xạ khuẩn, ủ ở 30oC trong 7 - 14 ngày.
Ngoài ra, chuỗi bào tử và bề mặt bào tử cũng đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử quét qua các bƣớc sau:
- Cố định mẫu: Đặt thỏi thạch có bào tử xạ khuẩn lên lam kính nghiêng 45oC trong bình có chứa osmium oxide 2% trong 2 - 3 giờ.
- Rửa mẫu: Mẫu đƣợc rửa lần lƣợt bằng ethanol ở các nồng độ 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% và 100% trong 15 phút. Sau đó, mẫu đƣợc ngâm trong isopentyl acetate 100% trong 12 giờ.
- Làm khô mẫu: Mẫu đƣợc làm khô bằng thiết bị có phun ngập khí nitơ trong 20 phút.
2.2.3. Hóa phân loại
2.2.3.1. Phân tích thành phần axit amin trong thành tế bào
Chuẩn bị thành tế bào: Tế bào ƣớt (1 - 2 ml) + 5 ml nƣớc cất vô trùng + hạt thủy tinh (loại lớn và nhỏ, đƣờng kính 0, 11 - 0, 12 mm). Phá tế bào bằng sóng siêu âm ca.180 trong 1 - 1,5 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong. Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ 30 phút. Bỏ dịch trên. Thêm 3 ml SDS 4%. Giữ ở 100oC trong 40 phút. Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ phút trong 30 phút ở 30oC loại bỏ dịch trên. Rửa với nƣớc ít nhất 3 lần với điều kiện giống trên (17000 vòng/ phút trong 30 phút). Đông khô qua đêm.
2 - 3 mg thành tế bào đƣợc bổ sung 200 μl HCl 4 N, ủ ở 100oC qua đêm. Mẫu đƣợc làm khô bằng hút chân không (khoảng 24 giờ). Thêm 200 μl nƣớc cất, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 12000 vòng/ phút trong 5 phút. Dịch trên đƣợc thu và lọc qua màng lọc.
Phân tích mẫu bằng sắc ký bản mỏng TLC: Mẫu (3 - 5 μl) và các axit amin chuẩn (1 μl) DAP, Ala, Gly, Glu, Lys đƣợc chấm lên bản sắc ký cellulose (phụ lục 1). Bản sắc ký đƣợc nhuộm bằng ninhydrin ở 100oC trong 5 phút. Các axit amin sẽ hiện lên dƣới dạng các chấm màu tím.
Phân tích mẫu bằng HPLC: 10 - 20 μl mẫu và các axit amin chuẩn (25 nmol) đƣợc làm khô bằng hút chân không trong 2 giờ, thêm 20 μl Ethanol/ DW/ Triethylamine 2/ 2/ 1, làm khô bằng hút chân không trong 2 giờ. Thêm 20 μl Ethanol/ DW/ Triethylamine/ Phenylisothiocyanate 7/ 1/ 1/ 1, giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, làm khô bằng hút chân không trong 2 giờ. Mẫu đƣợc hòa tan bằng 0,5 ml dung dịch A và đƣợc phân tích bằng HPLC (phụ lục 1).
2.2.3.2. Phân tích thành phần menaquinone
100 - 500 mg tế bào khô đƣợc hòa tan trong 10 - 15 ml Chloroform: methanol (2: 1), trộn bằng khuấy từ chậm trong 3 giờ. Ly tâm 3000 vòng/ phút
trong 10 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng cô quay. Hòa tan bằng 1,5 ml acetone, làm khô bằng hút chân không.
Mẫu đƣợc hòa tan bằng 50 μl ethanol, chấm lên bản gel silica. Menaquinone đƣợc phát hiện bằng tia UV, sau đó đƣợc cạo ra chuyển vào ống eppendorf, thêm 1,5 ml acetone, ly tâm 3000 vòng/ phút trong 5 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng nitơ lỏng. Thêm 50 - 100 μl ethanol, lọc và dùng làm mẫu chạy HPLC và khối phổ (MS) (phụ lục 2).
2.2.3.3. Phân tích thành phần axit béo
5 mg tế bào khô + dung dịch kiềm (R1) 1 ml, vortex 5 - 10 giây, giữ ở 100oC trong 5 phút, vortex 5 - 10 giây, giữ tiếp ở 100oC trong 25 phút, để nguội xuống nhiệt độ phòng, có thể đặt trực tiếp dƣới vòi nƣớc sau khi hạ xuống 80o
C. Thêm 2 ml dung dịch methyl hóa (R2) giữ ở 80oC trong 10 phút. Thêm 3 ml dung dịch tách (R3) trộn đều, loại bỏ lớp dƣới. Thêm 3 ml dịch rửa (R4), ly tâm 2000 vòng/ phút trong 3 phút, chuyển 2/3 lớp trên sang ống đựng mẫu. Mẫu đƣợc phân tích bằng sắc ký khí (hệ thống MIDI).
2.2.3.4. Phân tích thành phần G+C trong ADN
25 μl ADN (2 - 25 μg) giữ ở 60oC trong 1 giờ, giữ ở 100oC trong 2 phút, chuyển lên đá. Thêm 25 μl đệm acetate (phụ lục 5), giữ ở 37oC trong 1 giờ. Thêm 25 μl đệm Glycine (0,1 M, pH 10,4) và 2 μl alkaline photphatase (0,35 U/ μl), giữ ở 37oC trong 1 - 2 giờ. Phân tích bằng HPLC (phụ lục 4).
2.2.4. Phân loại sinh học phân tử giải trình tự 16S – rADN
Tách chiết ADN
Tế bào xạ khuẩn thu từ 1,5 ml dịch nuôi cấy đƣợc hòa tan trong 100 l TE, thêm 0,4 mg lysozyme, ủ 37oC trong 1 giờ. Thêm 100 l SDS 10% (w/v), ủ 37oC trong 30 phút. Thêm 8 l ARNase 3 mg/ ml, ủ ở 37oC trong 30 phút. Thêm 12 l
proteinase K (5 mg/ ml), ủ 15 phút ở 56oC. Thêm 1 V phenol: chloroform: isoamyl alcohol (P: C: I = 25: 24: 1), ly tâm 15000 vòng/ phút, 15 phút, thu lớp dịch trên. Thực hiện bƣớc này 3 lần. Thêm 1/ 10 V natri acetate 3 M và 2,5 V ethanol 100%, đặt trong đá 30 phút. Ly tâm 15000 vòng/ phút trong 15 phút, thu cặn, rửa bằng ethanol 70%. Làm khô, hoà tan trong 50 l TE.
Phản ứng khuếch đại ADN
Thành phần phản ứng (l): 10X buffer - 10; dNTP 2 mM - 10; mồi 27F (10 pM) - 2; 1525R (10 pM) - 2; Taq polymerase (5u/l) - 2; ADN khuôn (50 - 100g/
l) - 1- 2; H2O đủ 100 l Chu trình nhiệt: 35 chu kỳ 95oC - 3 phút
95oC - 30giây 55oC - 30 giây 72oC - 1 phút 4oC -
Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di agarose 1 %. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch bằng kit PCR clean up (QIAgen).
Phản ứng khuếch đại ADN cho đọc trình tự
Thành phần Terminator Ready Reaction Mix (Termix): Buffer 5X - 9 l, Bigdye Ready Reaction premix -18 l, H2O - 9l.
Thành phần phản ứng PCR: Termix - 8 l, dNTP 2 mM - 10, Mồi - 1 l, ADN khuôn - 1 l (nồng độ ADN là 40 - 60 g/ ml), H2O - 10 l.
96oC - 1phút
96oC - 10giây 25 chu kỳ 50oC - 5 giây
60oC - 4 phút
- Tinh sạch sản phẩm PCR:
Thêm 5 l EDTA 125 mM và 60 l ethanol 100%, để 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 15000 vòng/ phút trong 15 phút, thu cặn, rửa bằng 60 l ethanol 70%. Thêm 10 l HiDi Formamide. Để ở 96oC trong 2 phút sau đó chuyển ngay mẫu lên đá. Mẫu đƣợc đọc trình tự bằng máy ABI 3100 Avant.
Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Trình tự của ADNr 16S đƣợc phân tích bằng phần mềm CLUSTAL W. Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại đƣợc lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp của Saitou và Nei (1987) với độ lặp lại 1000 lần trên phần mềm ClustalX2 và ClustalW2.
2.2.5. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn
2.2.5.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
Chủng VN08 - A12 (3% giống cấp 1) đƣợc nuôi trong 25 ml của 6 môi trƣờng: 3M, 16M, 2M, 301, N8, SKS trong bình tam giác 250 ml, lắc ở 150 vòng/ phút trong 4 ngày. Dịch nuôi cấy sau ly tâm đƣợc thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.5.2. Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp
Chủng VN08 - A12 đƣợc nuôi cấy nhƣ trên trong môi trƣờng SKS. Dịch nuôi cấy (1 ml) đƣợc thu sau 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày, thử hoạt tính đối kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.5.3. Lựa chọn thể tích nuôi cấy thích hợp
Chủng VN08 - A12 (3% giống cấp 1) đƣợc nuôi trong 25, 50, 75, 100, 125, 150 ml môi trƣờng SKS trong bình tam giác 250 ml, lắc 150 vòng/ phút trong 4 ngày. Dịch nuôi cấy sau ly tâm đƣợc thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.5.4. Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy
Chủng VN08 - A12 đƣợc nuôi trong môi trƣờng SKS, lắc 150 vòng/ phút ở các nhiệt độ 25, 30, 35, 40o
C trong 4 ngày. Dịch nuôi cấy sau ly tâm đƣợc thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.5.5. Lựa chọn cách cấy giống
Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 đƣợc cấy bằng các cách khác nhau: giống cấp 1, giống cấp 2 và bào tử (1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108 bào tử/ ml), lắc 150 vòng/ phút ở 30oC trong 4 ngày. Dịch nuôi cấy sau ly tâm đƣợc thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.6. Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo 2.2.6.1. Tách dịch chiết thô 2.2.6.1. Tách dịch chiết thô
Dịch nuôi cấy (100 ml) đƣợc ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch trong. Thêm 50 ml ethylacetate, lắc đều, ly tâm ở 4o
C vận tốc 8000 vòng/ phút trong 10 phút. Thu lớp dịch phía trên, bổ sung khoảng 0,02 g Na2SO4, lắc đều, lọc lấy dịch trong, cô đến khô, hòa tan lại bằng 1 ml methanol.