CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.3.4. Phân tích thành phần G+C trong ADN
25 μl ADN (2 - 25 μg) giữ ở 60oC trong 1 giờ, giữ ở 100oC trong 2 phút, chuyển lên đá. Thêm 25 μl đệm acetate (phụ lục 5), giữ ở 37oC trong 1 giờ. Thêm 25 μl đệm Glycine (0,1 M, pH 10,4) và 2 μl alkaline photphatase (0,35 U/ μl), giữ ở 37oC trong 1 - 2 giờ. Phân tích bằng HPLC (phụ lục 4).
2.2.4. Phân loại sinh học phân tử giải trình tự 16S – rADN
Tách chiết ADN
Tế bào xạ khuẩn thu từ 1,5 ml dịch nuôi cấy đƣợc hòa tan trong 100 l TE, thêm 0,4 mg lysozyme, ủ 37oC trong 1 giờ. Thêm 100 l SDS 10% (w/v), ủ 37oC trong 30 phút. Thêm 8 l ARNase 3 mg/ ml, ủ ở 37oC trong 30 phút. Thêm 12 l
proteinase K (5 mg/ ml), ủ 15 phút ở 56oC. Thêm 1 V phenol: chloroform: isoamyl alcohol (P: C: I = 25: 24: 1), ly tâm 15000 vòng/ phút, 15 phút, thu lớp dịch trên. Thực hiện bƣớc này 3 lần. Thêm 1/ 10 V natri acetate 3 M và 2,5 V ethanol 100%, đặt trong đá 30 phút. Ly tâm 15000 vòng/ phút trong 15 phút, thu cặn, rửa bằng ethanol 70%. Làm khô, hoà tan trong 50 l TE.
Phản ứng khuếch đại ADN
Thành phần phản ứng (l): 10X buffer - 10; dNTP 2 mM - 10; mồi 27F (10 pM) - 2; 1525R (10 pM) - 2; Taq polymerase (5u/l) - 2; ADN khuôn (50 - 100g/
l) - 1- 2; H2O đủ 100 l Chu trình nhiệt: 35 chu kỳ 95oC - 3 phút
95oC - 30giây 55oC - 30 giây 72oC - 1 phút 4oC -
Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di agarose 1 %. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch bằng kit PCR clean up (QIAgen).
Phản ứng khuếch đại ADN cho đọc trình tự
Thành phần Terminator Ready Reaction Mix (Termix): Buffer 5X - 9 l, Bigdye Ready Reaction premix -18 l, H2O - 9l.
Thành phần phản ứng PCR: Termix - 8 l, dNTP 2 mM - 10, Mồi - 1 l, ADN khuôn - 1 l (nồng độ ADN là 40 - 60 g/ ml), H2O - 10 l.
96oC - 1phút
96oC - 10giây 25 chu kỳ 50oC - 5 giây
60oC - 4 phút
- Tinh sạch sản phẩm PCR:
Thêm 5 l EDTA 125 mM và 60 l ethanol 100%, để 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 15000 vòng/ phút trong 15 phút, thu cặn, rửa bằng 60 l ethanol 70%. Thêm 10 l HiDi Formamide. Để ở 96oC trong 2 phút sau đó chuyển ngay mẫu lên đá. Mẫu đƣợc đọc trình tự bằng máy ABI 3100 Avant.
Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Trình tự của ADNr 16S đƣợc phân tích bằng phần mềm CLUSTAL W. Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại đƣợc lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp của Saitou và Nei (1987) với độ lặp lại 1000 lần trên phần mềm ClustalX2 và ClustalW2.
2.2.5. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn
2.2.5.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
Chủng VN08 - A12 (3% giống cấp 1) đƣợc nuôi trong 25 ml của 6 môi trƣờng: 3M, 16M, 2M, 301, N8, SKS trong bình tam giác 250 ml, lắc ở 150 vòng/ phút trong 4 ngày. Dịch nuôi cấy sau ly tâm đƣợc thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.5.2. Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp
Chủng VN08 - A12 đƣợc nuôi cấy nhƣ trên trong môi trƣờng SKS. Dịch nuôi cấy (1 ml) đƣợc thu sau 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày, thử hoạt tính đối kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.5.3. Lựa chọn thể tích nuôi cấy thích hợp
Chủng VN08 - A12 (3% giống cấp 1) đƣợc nuôi trong 25, 50, 75, 100, 125, 150 ml môi trƣờng SKS trong bình tam giác 250 ml, lắc 150 vòng/ phút trong 4 ngày. Dịch nuôi cấy sau ly tâm đƣợc thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.5.4. Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy
Chủng VN08 - A12 đƣợc nuôi trong môi trƣờng SKS, lắc 150 vòng/ phút ở các nhiệt độ 25, 30, 35, 40o
C trong 4 ngày. Dịch nuôi cấy sau ly tâm đƣợc thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.5.5. Lựa chọn cách cấy giống
Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 đƣợc cấy bằng các cách khác nhau: giống cấp 1, giống cấp 2 và bào tử (1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108 bào tử/ ml), lắc 150 vòng/ phút ở 30oC trong 4 ngày. Dịch nuôi cấy sau ly tâm đƣợc thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.6. Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo 2.2.6.1. Tách dịch chiết thô 2.2.6.1. Tách dịch chiết thô
Dịch nuôi cấy (100 ml) đƣợc ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch trong. Thêm 50 ml ethylacetate, lắc đều, ly tâm ở 4o
C vận tốc 8000 vòng/ phút trong 10 phút. Thu lớp dịch phía trên, bổ sung khoảng 0,02 g Na2SO4, lắc đều, lọc lấy dịch trong, cô đến khô, hòa tan lại bằng 1 ml methanol.
2.2.6.2. Tinh sạch bằng silica gel
Silica gel (20 ml) hòa vào hexan và nhồi vào cột. Các dung môi cần sử dụng: (1). Hexan 100%
(4). 20% Hexan: 80% ethyl acetate (5). 0% Hexan: 100% ethyl acetate (6). 50% Methanol: 50% ethyl acetate
Chuyển dịch chiết thô lên cột. Các dung môi (1), (2), (3), (4), (5), (6) đƣợc lần lƣợt thêm vào cột (40 ml), các phân đoạn đƣợc thu tƣơng ứng, cô quay đến khô, hòa tan trong 1 ml methanol. Các phân đoạn đƣợc thử hoạt tích kháng Xoo R2 bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch.
2.2.6.3. Tinh sạch bằng HPLC
Các phân đoạn có hoạt tính đƣợc phân tích và tinh sạch bằng phƣơng pháp HPLC sử dụng cột Cadenza CD - C18 (7,5 x 4,6 mm). Nồng độ acetonitrile đƣợc tăng tuyến tính từ 15% đến 85% trong 22 phút với tốc độ 1,2 ml/ phút.
Kênh A: Nƣớc MQ: Axit formic = 1000: 1 Kênh B: Acetonnitrile Bảng 4. Chƣơng trình phân tích HPLC Thời gian (phút) Dịch A (%) Dịch B (%) Tốc độ (ml/ phút) 0 85 15 1 3 85 15 1 25 15 85 1 29 15 85 1 32 85 15 1 35 85 15 1
Chất kháng Xoo đã đƣợc tinh sạch qua máy HPLC đƣợc phân tích trọng lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp khối phổ. Mẫu đƣợc bơm trực tiếp vào máy khối phổ ở trạng thái tích điện dƣơng.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khả năng kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 3.1. Khả năng kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12
Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 đƣợc tiến hành thử hoạt tính kháng với 10 chủng Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) từ R1 đến R10 bằng phƣơng pháp thỏi thạch. Kết quả đƣờng kính vòng hoạt tính kháng Xoo đƣợc thể hiện trong bảng 5. Bảng 5. Hoạt tính kháng 10 chủng Xoo của chủng xạ khuẩn VN08 - A12
Chủng Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D-d: mm)
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10
VN08- A12
10±1 14±1 18±1 12±4 8±1 14±2 8±1 5±1 8±1 10±1
Kết quả trong bảng 5 cho thấy chủng VN08 - A12 có khả năng kháng cả 10 chủng Xoo. Trong đó, chủng này có khả năng kháng mạnh đối với R2, R3 và R6 nhƣng kháng yếu với R8.
Mục đích của nghiên cứu này là lựa chọn chủng có khả năng kháng đƣợc tất cả 10 chủng Xoo nhƣng không gây hại cho vi sinh vật khác. Chính vì vậy, khả năng ức chế đối với 5 vi sinh vật kiểm và 2 vi sinh vật hữu ích của chủng xạ khuẩn này đƣợc tiếp tục thử nghiệm. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 6 và bảng 7.
Bảng 6. Hoạt tính kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12
STT Chủng Vi sinh vật kiểm đinh Đƣờng kính vòng kháng
khuẩn (D-d: mm)
1 Pseudomonas putida VTCC - B-657 -
2 Fusarium oxysporum ATCC - 7601 -
3 Staphylococcus aureus ATCC - 29923 -
4 Saccharomyces cerevisiae VTCC - Y - 62 -
Kết quả cho thấychủng xạ khuẩn VN08 - A12 không ức chế vi sinh vật kiểm định nào. Ngoài ra, chủng VN08 - A12 có khả năng tăng trƣởng khá nhanh. Vì vậy, chủng VN08 - A12 đƣợc tiếp tục kiểm tra khả năng ức chế đối với hai vi sinh vật có lợi Azotobacter sp. (VTCC - B - 106) và Pseudomonas putida (VTCC - B - 657). Kết quả thử hoạt tính cho thấy chủng VN08 - A12 không kháng cả hai loại vi khuẩn đƣợc kiểm tra này (Bảng 7). Nhƣ vậy, chủng VN08 - A12 có khả năng kháng rất đặc hiệu với vi khuẩn Xoo.
Bảng 7. Hoạt tính kháng vi sinh vật có lợi của chủng xạ khuẩn VN08 - A12
Chủng xạ khuẩn Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D - d, mm) Azotobacter sp. (VTCC - B - 106) Pseudomonas putida (VTCC - B - 657) VN08 - A12 - -
3.2. Phân loại chủng VN08 - A12
3.2.1. Phân loại bằng hình thái
Sau 7 ngày nuôi cấy trên đĩa thạch YS, chủng VN08 - A12 tạo khuẩn lạc lồi, mép tạo viền có dạng sợi tia nhỏ, hệ sợi khí sinh có màu từ trắng đến nâu. Hệ sợi cơ chất có màu nâu nhạt (hình 7A). Đƣờng kính khuẩn lạc 0,5 - 2,5 mm, không tiết sắc tố vào môi trƣờng.
Chuỗi bào tử của chủng VN08 - A12 có dạng thẳng, dài, thƣờng có trên 20 bào tử trong một chuỗi (hình 7B và hình 8C). Khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử quét (SEM) bề mặt bào tử có dạng nhẵn (hình 8D).
3.2.2. Hóa phân loại
3.2.2.1. Thành phần axit amin trong thành tế bào
Thành phần axit amin trong thành tế bào của chủng VN08 - A12 đƣợc xác định bằng sắc ký bản mỏng nhƣ đã mô tả trong phần phƣơng pháp (hình 9). Kết quả so sánh với chất chuẩn cho thấy chủng VN08 - A12 chứa LL - DAP. (DAP: Diaminopimelic).
Hình 7. Khuẩn lạc và chuỗi bào tử của chủng VN08 - A12
(Ảnh SEM ở 15KVx 5,000) (Ảnh SEM ở 10KVx 30,000)
Hình 8. Chuỗi bào tử và bào tử của chủng VN08 - A12
1µm
A B
D C
Hình 9. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng thành phần axit amin trong thành tế bào của chủng VN08 - A12.
(1). Chất chuẩn Meso - DAP và LL - DAP (2). Mẫu VN08 - A12
3.2.2.2. Thành phần menaquinone
Thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12 đƣợc phân tích theo phƣơng pháp đã đƣợc trình bày trong mục 2.2.3.2. Mẫu menaquinone sau khi đƣợc phân tách bằng sắc ký bản mỏng đƣợc thu lại để phân tích bằng LC - MS. Hai đỉnh ở phút 14,019 và 15, 689 trên LC đƣợc xác định tƣơng ứng là MK - 9(H6) và MK - 9(H8) bằng phân tích khối phổ đi kèm (hình 10). Kết quả phân tích diện tích của hai đỉnh này đƣợc thể hiện trong bảng 8, cho thấy thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12 là MK - 9 (H6) 51,9% và MK-9(H8) 48,1%.
1 2
Meso - DAP
LL - DAP Chủng VN08 -A12:
Hình 10. Kết quả phân tích LC thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12. Bảng 8 : Kết quả phân tích thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12
Peak Thời gian lƣu Diện tích peak Chiều cao peak Phần trăm diện tích peak (%) Phần trăm chiều cao peak (%) Loại menaquinone của VN08 -A12 1 14,019 840142 44224 51,961 55,145 MK - 9 (H6) 2 15,689 776728 35972 48,039 44,55 MK - 9(H8) Tổng 1616869 80196 100,00 100,000 3.2.2.3.Thành phần axit béo
Thành phần axit béo của chủng VN08 - A12 đƣợc phân tích bằng hệ thống sắc ký khí kết hợp với phần mềm MIDI theo phƣơng pháp đƣợc trình bày trong mục 2.2.3.3. Kết quả phân tích đƣợc thể hiện trong hình 11 và bảng 9, cho thấy chủng
VN08 - A12 có thành phần axit béo gồm anteios - (anteios - C15 : 0), iso - (iso - C16 : 0) và (n - C16 : 0).
Hình 11. Sắc ký đồ thành phần axit béo của chủng VN08 - A12 Bảng 9. Kết quả phân tích thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12
Thời gian lƣu Tên peak Tỷ lệ phần trăm
6,974 14: 0 iso 1,77 7,503 14: 0 0,77 8,478 15: 0 iso 9,18 8,619 15: 0 anteiso 19,25 9,064 15: 0 1,13 9,838 16: 1 iso H 2,45 10,119 16: 0 iso 16,02 10,441 16:1 cis 9 11,16 10,744 16: 0 10,09
Thời gian lƣu Tên peak Tỷ lệ phần trăm 11,472 16:0 9 methyl 5,41 11,661 17: 1 anteiso 4,89 11,840 17: 0 iso 4,19 12,003 17: 0 anteiso 11,53 12,127 17: 1 0,75 12,438 17: 0 10 methyl 0,45 13,205 18: 1 iso H 0,41 3.2.2.4. Thành phần G+C trong AND
Thành phần GC của chủng VN08 - A12 đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp HPLC nhƣ đƣợc trình bày trong mục 2.2.3.4. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 12 và bảng 10. Kết quả phân tích cho thấy rằng thành phần GC trong ADN của chủng VN08 - A12 là 75%.
Hình 12. Sắc ký đồ thành phần GC của chủng VN08 - A12
A
C G
Bảng 10. Kết quả phân tích thành phần GC của chủng VN08 - A12
Peak Thời gian lƣu Diện tích peak Chiều cao peak Phần trăm diện tích peak (%) Phần trăm chiều cao peak (%) Thành phần GC 1 2,299 1063153 162556 38,736 40,537 C 2 4,058 1019074 161599 37,130 40,298 G 3 6,302 327432 40445 11,930 10,086 T 4 6,841 334930 36411 12,203 9,080 A Tổng 2744589 401012 100,000 100,000 3.2.3. Trình tự 16S rADN
Kết quả trình tự gen 16S rADN của chủng VN08 - A12 (phụ lục 8).
Căn cứ vào các kết quả phân tích về hình thái đƣợc thể hiện trong phần 3.2.1. cho thấy chủng VN08-A12 có đặc điểm điển hình của chi Streptomyces. Phân tích thành phần axit amin trong thành tế bào của chủng VN08 - A12 đặc trƣng bởi LL - DAP. Các thành phần chính của axit béo là anteios- (anteios - C15 : 0), ISO - (iso - C16 : 0) và bình thƣờng (n- C16 : 0) axit. Các menaquinones là MK-9 (H6) 51,9% và MK-9 (H8) 48,1%. Thành phần GC là 75%..
Kết quả Blast search trên GenBank cho thấy chủng VN08 - A12 có trình tự 16S rADN hoàn toàn tƣơng đồng với loài Streptomyces toxytricini với tỉ lệ 100%. Cây phân loại của chủng VN08 - A12 đƣợc dựng bằng phần mềm ClustalX2 và ClustalW2 cho thấy chủng nghiên cứu nằm trong cùng nhóm với nhóm chủng
Streptomyces toxytricini (hình 13). Nhƣ vậy căn cứ vào các kết quả phân tich về hình thái, đặc điểm sinh lý sinh hóa, hóa phân loại và trình tự 16s rADN của chủng VN08 - A12 cho thấy chủng VN08 - A12 thuộc chi Streptomyces toxytricini.
Hình 13. Cây phân loại chủng VN08 - A12 dựa trên trình tự gen 16S – rADN.
3.3. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng VN08 - A12
3.3.1. Môi trường nuôi cấy thích hợp
Để lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy của chủng VN08 - A12 để đạt hoạt tính kháng Xoo cao nhất, 6 loại môi trƣờng đã đƣợc lựa chọn để thử nghiệm bao gồm 3M, 16M, 2M, 301, N8 và SKS. Chủng VN08 - A12 đƣợc nuôi trong 25 ml của mỗi loại môi trƣờng trong bình tam giác 250 ml, lắc ở 150 vòng/ phút trong 4 ngày ở nhiệt độ 30oC. Dịch nuôi cấy sau ly tâm đƣợc thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo phƣơng pháp đục lỗ thạch. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 14 và hình 28C. Kết quả cho thấy, môi trƣờng SKS là môi trƣờng tốt nhất cho chủng VN08 - A12 để sản sinh chất kháng Xoo.
Hình 14. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12
3.3.2. Thời gian nuôi cấy thích hợp
Chủng VN08 - A12 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng SKS ở 30oC, dịch nuôi cấy đƣợc thu và thử hoạt tính kháng Xoo ở các ngày khác nhau. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 15 và hình 28B. Kết quả cho thấy rằng, thời gian nuôi cấy ảnh hƣởng đến sự sản sinh lƣợng chất kháng Xoo. Khả năng ức chế Xoo (R2) đạt cao nhất sau 4 ngày nuôi cấy và giảm dần khi tăng thời gian nuôi cấy.
Hình 15. Ảnh hƣởng của thời gian cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12
0 5 10 15 20 25 30 35 3M 16M 2M 301 N8 SKS Đ ư ờ n g k ín h vòn g k há n g k hu ẩn ( D - d: m m )
Môi trường nuôi cấy
0 5 10 15 20 25 30 3 4 5 6 7 Đ ư ờ n g k ín h vòn g k há n g k hu ẩn (D :m m )
3.3.3. Thể tích nuôi cấy thích hợp
Để xác định thể tích nuôi cấy thích hợp, chủng VN08 - A12 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng SKS với các thể tích khác nhau ở 30o
C. Sau 4 ngày, dịch nuôi cấy đƣợc thu để thử hoạt tính kháng Xoo. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 16 và hình 28A. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng Xoo cao nhất ở thể tích 25 ml trong bình 250 ml và giảm dần với sự gia tăng của thể tích môi trƣờng. Kết quả này khẳng định oxy là nhân tố quan trọng ảnh hƣởng khả năng sinh hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08 - A12.
Hình 16. Ảnh hƣởng của thể tích môi trƣờng nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 (S. toxytricini)
3.3.4. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Chủng VN08 - A12 đƣợc nuôi trong môi trƣờng SKS, ở các nhiệt độ khác