CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.3.1. Phân tích thành phần axit amin trong thành tế bào
Chuẩn bị thành tế bào: Tế bào ƣớt (1 - 2 ml) + 5 ml nƣớc cất vô trùng + hạt thủy tinh (loại lớn và nhỏ, đƣờng kính 0, 11 - 0, 12 mm). Phá tế bào bằng sóng siêu âm ca.180 trong 1 - 1,5 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong. Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ 30 phút. Bỏ dịch trên. Thêm 3 ml SDS 4%. Giữ ở 100oC trong 40 phút. Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ phút trong 30 phút ở 30oC loại bỏ dịch trên. Rửa với nƣớc ít nhất 3 lần với điều kiện giống trên (17000 vòng/ phút trong 30 phút). Đông khô qua đêm.
2 - 3 mg thành tế bào đƣợc bổ sung 200 μl HCl 4 N, ủ ở 100oC qua đêm. Mẫu đƣợc làm khô bằng hút chân không (khoảng 24 giờ). Thêm 200 μl nƣớc cất, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 12000 vòng/ phút trong 5 phút. Dịch trên đƣợc thu và lọc qua màng lọc.
Phân tích mẫu bằng sắc ký bản mỏng TLC: Mẫu (3 - 5 μl) và các axit amin chuẩn (1 μl) DAP, Ala, Gly, Glu, Lys đƣợc chấm lên bản sắc ký cellulose (phụ lục 1). Bản sắc ký đƣợc nhuộm bằng ninhydrin ở 100oC trong 5 phút. Các axit amin sẽ hiện lên dƣới dạng các chấm màu tím.
Phân tích mẫu bằng HPLC: 10 - 20 μl mẫu và các axit amin chuẩn (25 nmol) đƣợc làm khô bằng hút chân không trong 2 giờ, thêm 20 μl Ethanol/ DW/ Triethylamine 2/ 2/ 1, làm khô bằng hút chân không trong 2 giờ. Thêm 20 μl Ethanol/ DW/ Triethylamine/ Phenylisothiocyanate 7/ 1/ 1/ 1, giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, làm khô bằng hút chân không trong 2 giờ. Mẫu đƣợc hòa tan bằng 0,5 ml dung dịch A và đƣợc phân tích bằng HPLC (phụ lục 1).