Các nhân tố phiên mã NAC là một trong nhóm lớn nhất của các chất điều hòa phiên mã trong thực vật, và các thành viên của nhóm gen NAC đóng vai trò quan trọng điều khiển quá trình phiên mã kết hợp với phản ứng stress của thực vật [37]. Trong vùng trình
tự đầu tiên của cDNA mã hóa một protein NAC là gen đáp ứng với sự mất nước (RD26) ở trong cây Arabidopsis [63]. Vùng NAC được đặc trưng cơ bản trên các trình tự nhất quán từ các protein NAM trong cây thuốc lá (Petunia) và ATAF1/2 và CUC2 trong Arabidopsis
[8]. Nhiều TFs NAC bao gồm CUC2 trong Arabidopsis đóng vai trong sự phát triển của thực vật một vài gen NAC làm trung gian kháng virus [38], trong khi đó một số nhóm khác tăng khả năng điều hòa cân bằng khi bị tổn thương và nhiễm khuẩn [12].
Các domain NAC được biết đến như là trung gian cho sự điều hòa phiên mã của các quá trình sinh học khác nhau bằng việc tạo cấu trúc helix-turn-helix liên kết đặc biệt với DNA đích [9]. Các TFs NAC thay đổi khác nhau không nhiều lắm trong trình tự kết thúc -C của chúng và có khả năng hoạt hóa hoặc ngăn chặn sự hoạt động. Có hơn 100 gen
NAC đã được phát hiện trong cây Arabidopsis và lúa, chúng được phân loại vào 6 nhóm chính. TFs NAC đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của thực vật và đáp ứng stress phi sinh học [38]. Ở một số loài thực vật quá trình sinh trưởng và phát triển được điều khiển bởi TFs NAC, bao gồm hình thành hệ thống phân sinh đỉnh chồi, sự phát triển rễ bên, quá trình già hóa, sự phát triển thành tế bào, và trao đổi chất thứ cấp. Phần lớn các TFs NAC có biểu hiện khác nhau trong quá trình đáp ứng với stress sinh học và phi sinh học [61] và ở các cây Arabidopsis và lúa biến đổi gen NAC có biểu hiện đáp ứng mạnh với stress giúp cải thiện khả năng chống chịu hạn hán. Các nghiên cứu này cho thấy các nhân tố phiên mã NAC đáp ứng với stress đóng vai trò quan trọng khi điều khiển làm tăng cường khả năng đáp ứng của thực vật với stress phi sinh học và có thể cải thiện khả năng chống chịu với stress nhờ vào kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại [38].
Thú vị hơn, sự biểu hiện quá mạnh của OsNAC6 ở các cây lúa đã tăng cường khả năng chống chịu với các stress phi sinh học (mất nước, nồng độ muối cao) cũng như là trong điều kiện stress sinh học (bệnh đạo ôn) [40]. Trong cây Arabidopsis yếu tố phiên
mã NAC, ATAF2 được kích hoạt bằng cách xử lý salicylic acid và methyl jasmonate, và
có biểu hiện khác nhau trong quá trình đáp ứng lại sự tổn thương [20]. Gen StNAC trong cây khoai tây cho thấy cũng biểu hiện trong quá trình đáp ứng với lây nhiễm
TFs NAC trong thực vật đóng vai trò đa dạng trong việc đáp ứng quá trình chống chịu với sự tấn công của các nguồn bệnh cũng như các kích thích bên ngoài [61].
Trong các công trình nghiên cứu của Lam-Son Phan Tran và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng ở đậu tương trong số 31 gen điều khiển GmNAC thuộc nhóm gen điều khiển NAC
được kiểm tra, có 9 gen liên quan đến khả năng chịu hạn, mặn và lạnh. Trong số các gen
GmNAC này thì các gen ở NST số 1 (GmNAC002, GmNAC003, GmNAC004) có khả năng
biểu hiện mạnh hơn cả [36]. Cùng với đó Lê và cộng sự (2011), cũng cho thấy ở đậu tương có ít nhất 205 gen GmNAC điều khiển, ít nhất có 31 gen tham gia vào khả năng chống chịu, đặc biệt là gen GmNAC085 [29]. Mặt khác, bộ gen của đậu tương đã được giải mã hoàn toàn tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu toàn diện các gen điều khiển (transcription factors) ở đậu tương [51]. Rõ ràng rằng, nghiên cứu phân lập và sử dụng hế thống gen điều khiển trong chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen chống chịu các điều kiện bất lợi đang là hướng đi được rất nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm.
Trong những năm gần đây, các công bố đã chỉ ra rằng các gen mã hóa các yếu tố phiên mã NAC (NAM, ATAF và CUC) có khả năng tham gia vào quá trình chống chịu của cây trồng đối với các điều kiện bất thuận như hạn, mặn và lạnh [56]. Các nghiên cứu sâu về yếu tố NAC trên một số cây trồng đã đưa ra giả thuyết là ít nhất có 105 yếu tố phiên mã
NAC ở cây Arabidopsis, 140 ở cây lúa, 205 ở cây đậu tương và 152 ở cây thuốc lá [15]; [36]; [42]; [48]. Cùng với việc khám phá ra khả năng sử dụng các gen NAC để làm tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất thuận ở cây mô hình Arabidopsis, rất nhiều nghiên cứu ứng dụng thành công gen NAC trên cây trồng bằng kỹ thuật biến đổi gen đã được công bố [19]. Cây lúa được chuyển gen NAC1 cho kết quả chịu hạn và mặn tốt ở giai đoạn 4 lá, ngoài ra cây chuyển gen còn cho năng suất cao hơn đối chứng từ 22-34% [19]. Tuy nhiên, chỉ một vài gen nhóm NAC được phát hiện trong cây ngô. Lu và cộng sự (2012), đã phân lập và nghiên cứu chức năng đặc trưng của gen ZmNAC1 từ ngô. Phân tích sự biểu hiện cho thấy gen ZmNAC1 có khả năng thích nghi cao với nhiệt độ thấp, nồng độ muối cao, stress hạn và xử lý với ABA, nhưng khả năng điều hòa giảm xuống khi xử lý với salicylic acid. Khi tiến hành thí nghiệm ở cấp độ dưới mức tế bào của tế bào
nguyên sinh chất cho thấy ZmNAC1 tồn tại ở trong nhân. Phân tích microarray đã chứng minh được chức năng ZmNAC1 như là chất hoạt hóa phiên mã. Sự biểu hiện mạnh của
ZmNAC1 trong cây Arabidopsis dẫn đến sự nhạy cảm với ABA và stress thẩm thấu ở giai
đoạn nảy mầm, nhưng tăng cường khả năng chống chịu với sự mất nước khi so sánh với hạt nảy mầm wild-type. Kết quả đó chứng minh được chức năng của ZmNAC1 như các yếu tố phiên mã để đáp ứng với bất lợi phi sinh học và có thể áp dụng trong các kỹ thuật tăng cường khả năng chống chịu với hạn hán trên đồng ruộng [32].
Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa. Ngô được trồng trong những điều kiện sinh thái khác nhau trên nhiều vùng. Thời vụ trồng ngô chủ yếu được căn cứ vào tác động của chế độ nhiệt, lượng mưa. Hầu như các diện tích trồng ngô của nước ta là không chủ động được về tưới tiêu. Chọn tạo giống cây trồng nói chung và giống ngô chịu hạn nói riêng là nội dung quan trọng nhất mà các nhà tạo giống ở Việt Nam và trên toàn thế giới đang tập trung giải quyết. Các phương pháp chọn giống truyền thống, phương pháp gây đột biến và các phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS), cũng như phương pháp biến nạp các gen chức năng đã được ứng dụng trong chọn tạo giống nhằm cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng và đã thu được một số thành công nhất định. Xuất phát từ những vấn đề và yêu cầu cấp thiết này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu thực vật sử dụng để tách chiết và phân lập gen: Giống ngô tẻ Cao Bằng (NTCB) do viện Nghiên cứu Ngô cung cấp và được lưu giữ tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.
Vật liệu để biến nạp gen: Sử dụng 3 dòng ngô VH1, CM8, CH9.
2.1.2. DNA plasmid và chủng vi khuẩn
Vector nhân dòng pGEM–T Easy, vector biểu hiện pZY:CaMV35S, chủng vi khuẩn E. coli DH5α, chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101 được cung cấp bởi Trung tâm Quốc gia về Công nghệ sinh học Đậu tương, Đại học Missouri, Columbia, Missouri, Hoa Kỳ.
2.1.3. Hóa chất
Các loại hóa chất thông dụng: Thang DNA 1kb plus (Fermentas), thang DNA 1kb (Fermentas), Plasmid DNA extraction kit, PCR extraction kit, Gel purification kit (Invitrogen), ampicillin, spectinomycin, streptomycin, agarose, của hãng Merck, Sigma.
Các hóa chất dùng cho tách chiết DNA và RNA tổng số: Nitơ lỏng, CTAB, EDTA, DEPC, NaCl, isopropanol, β-mecaptoethanol, Ethanol, Trizol Reagent, Chloroform, isoamylalcohol, DNase, RNase…
Các hóa chất dùng cho tách dòng gen: Enzyme giới hạn AscI, BamHI, môi trường LB, kháng sinh chọn lọc, T4 DNA ligase…
Dung dịch điện di DNA và RNA: Dung dịch đệm TAE, agarose 1%, ethidium bromide (EtBr).
Một số hóa chất cho nuôi cấy mô đều thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế Bào Thực vât, Viện Di truyền Nông nghiệp mua từ các hãng nổi tiếng như Invitrogen, Merk, Amers ham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs.
2.1.4. Các thiết bị máy móc
Quá trình thực hiện đề tài sử dụng Pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh (amersham Pharmacia Biotech, máy ly tâm (Ependorf), máy đo pH (Mettler), bộ điện di (Bio-Rad), máy ly tâm hút chân không (Savant), máy PCR (MJ Research), bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, máy đo OD, máy vortex, … của Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.
2.1.5. Địa điểm nghiên cứu
Luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp, Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Phương pháp tìm kiếm dữ liệu và thiết kế mồi đặc hiệu cho gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 ZmNAC1
Để tiến hành tách chiết và phân lập gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống NTCB, chúng tôi đã truy cập cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen genebank NCBI có mã số (gb|DQ333304.1|) và |EU224278.1|. Dựa vào trình tự trên ngân hàng gen chúng tôi đã tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống NTCB sử dụng phần mền thiết kế Primer 3 cho kỹ thuật RT-PCR (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi Tm (oC)
ZmNfyb2Asc-F 5’-ACAAAAGGCGCGCCATGGCGGAAGCTCCGGCGAG-3’ 74,1 ZmNfyb2Asc-R 5’-ACAAAAGGCGCGCCTTAGTTTGAGATATCCCCGTTATG-3’ 65,5 ZmNAC1BamHI-F 5’- ACAAAGGATCCATGAGCGGCGCCGGTCCGGA-3’ 71,4 ZmNAC1BamHI-R 5’-ACAAAAGGATCCTAGAACGGCTTGCCCCAGTACATG-3’ 66,9
T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ 45,6
35S-F 5’-CTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’ 58,4
Bar-F 5’-TTGAGCAGATCTCGGTGACG-3’ 60,9
Bar-R 5’-CCACTGACGTAAGGGATGAC-3’ 56,4
2.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA
2.2.2.1. Chuẩn bị vật liệu cho tổng hợp cDNA
Hạt ngô sau khi khử trùng được nảy mầm trên giấy thấm 7 – 8 ngày ở 26oC trong điều kiện 16 giờ sáng và 8 giờ tối. Sau khi nảy mầm 7 – 8 ngày các cây ngô được xử lý với sorbitol nồng độ 0.2M ở 26oC với các thời gian khác nhau. Mẫu được thu ở các thời điểm khác nhau: 0 giờ, 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ, và 24 giờ sau khi xử lý với sorbitol, sau đó cho ngay mẫu vào nitơ lỏng. Tiếp theo sẽ tiến hành tách chiết RNA tổng số với hóa chất Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Tiếp đó tiến hành xử lý RNA tổng số với DNase để loại bỏ DNA và được sử dụng làm vật liệu để tổng hợp cDNA sợi đơn.
2.2.2.2. Quy trình tách chiết RNA tổng số từ mẫu ngô
Sau khi thu mẫu ngô, tiến hành tách chiết RNA tổng số theo quy trình sau:
- Nghiền 100 mg mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ cho đến khi thành bột mịn. Chuyển nhanh mẫu sang ống eppendorf 2ml.
- Bổ sung ngay 1ml hóa chất Trizol và vortex trong 1 phút.
- Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 0.2 ml Chloroform và vortex khoảng 1 phút.
- Ủ 2-3 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 13000 rpm ở 4oC, 15 phút.
- Chuyển dịch pha trên sang ống eppendorf mới (RNase-free).
- Bổ sung isopropanol (RNase-free) tỷ lệ 1:1 với mẫu và đảo đều sau đó đặt trong tủ -20oC, 2 giờ.
- Li tâm 13000 rpm ở 4oC, 15 phút.
- Li tâm 13000 rpm ở 4oC, 15 phút.
- Làm khô RNA ở nhiệt độ phòng.
- Hòa tan RNA trong nước (RNase-free) và giữ ở tủ -20oC.
2.2.2.3. Phương pháp khử DNA Bảng 2.2. Thành phần phản ứng STT Thành phần Thể tích (µl) 1 10X Buffer 3 2 DNase 1,5 3 RNA tổng số 3 4 H2O (RNase-free) 22,5 5 Tổng 30 Quy trình: - Ủ hỗn hợp trên ở 37oC trong 30 phút.
- Bổ sung 6 µl hóa chất Inactivation.
- Để nhiệt độ phòng 2 phút, lắc nhẹ nhàng.
- Ly tâm 13000 ở 4o
C khoảng 1,5 phút.
- Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới.
- Kiểm tra độ tinh sạch và chất lượng DNA bằng điện di và đo nồng độ DNA bằng máy nanodrop.
- Lưu giữ ở tủ -80oC.
2.2.2.4. Phương pháp tổng hợp cDNA sợi đơn
RNA tổng số được sử dụng để nhân gen bằng phương pháp tổng hợp cDNA của hãng Invitrogen theo quy trình sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng STT Thành phần Thể tích (µl) 1 RNA tổng số 4 2 Primer* 50µM oligo (dT)20 1 3 dNTP mix (10 mM) 1 4 DEPC-treated water 4 5 Tổng 10 - Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (bảng 2.3). - Ủ ở 65o
C trong 5 phút, sau đó đặt ngay lên đá ít nhất 1 phút.
- Chuẩn bị phản ứng tổng hợp cDNA theo thành phần bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA STT Thành phần Thể tích (10 µl) 1 Buffer (10X) 2 2 MgCl 2 (25mM) 4 3 DTT (0,1 M) 2 4 RNaseOUTTM (40 U/µl) 1 5 SuperScriptTM III RT (200U/µl) 1
- Bổ sung 10µl thành phần phản ứng tổng hợp cDNA (bảng 2.4) vào ống thành phần (bảng 2.3) mix và ly tâm nhẹ nhàng. Ủ ở 50oC trong 50 phút.
- Ly tâm nhẹ nhàng. Bổ sung 1 µl RNaseH hỗn hợp và ủ ở 37oC trong 20 phút.
- Phản ứng tổng hợp cDNA có thể được lưu giữ ở tủ -20oC hoặc sử dụng cho phản ứng PCR ngay lập tức.
2.2.3. Tách dòng gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống NTCB
2.2.3.1. Phương pháp khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 và gen ZmNAC1 từ cDNA
Gen ZmNF-YB2 được khuếch đại từ cDNA của giống NTCB bằng kỹ thuật PCR
với cặp mồi đặc hiệu: ZmNfyb2Asc-F/ZmNfyb2Asc-R. Vùng mã hóa cho gen ZmNAC1
được khuếch đại với cặp mồi ZmNAC1BamHI-F/ZmNAC1BamHI-R (bảng 2.1) theo quy trình sau:
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA
STT Thành phần Thể tích (50 µl) 1 Buffer (10X) 5 2 MgCl2 (25 mM) 5 3 dNTP (10 mM) 5 4 Primer F (10 pmol/µl) 5 5 Primer R (10 pmol/µl) 5
6 Phusion Taq DNA polymerase (5U/µl) 1
7 cDNA (100 ng) 1
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Chu trình nhiệt PCR gen ZmNF-YB2 Chu trình nhiệt PCR gen ZmNAC1
Biến tính 95oC 2 phút Biến tính 98oC 2 phút
Biến tính 95oC 30 giây
40 chu kỳ
Biến tính 95oC 30 giây
40 chu kỳ
Gắn mồi 59oC 30 giây Gắn mồi 57oC 30 giây
Kéo dài 72oC 45 giây Kéo dài 72oC 45 giây
Kéo dài 72o
C 10 phút Kéo dài 72o
C 10 phút
Giữ 10oC ∞ Giữ 10oC ∞
2.2.3.2. Phương pháp tách dòng gen
Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit GenCatchTM Advanced Gel extraction
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm.
- Bổ sung đệm hòa tan GEX theo tỷ lệ: V mẫu:V GEX = 1:3 (1 µl tương ứng với 1 mg mẫu).
- Ủ ở 55oC, 15 phút trộn nhẹ một lần, đến khi gel tan hết.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel GenCatchTM Advanced Gel Extraction Column, ly tâm 13000 rpm 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Rửa cột một lần với 0,5 ml buffer WN bằng ly tâm 30 giây 13000 rpm.
- Rửa cột một lần với 0,5 ml buffer WS bằng ly tâm 60 giây 13000 rpm.
- Ly tâm 13000 rpm 3 phút để loại bỏ toàn bộ ethanol.
- Chuyển cột sang ống tube 1.5 ml mới. Bổ sung 30 ul buffer EB vào giữa cột.
- Để cột 2 phút và ly tâm 13000 rpm 60 giây để hòa thu DNA. Lưu giữ DNA ở tủ - 20oC.
Gắn đầu 3’A Overhang vào sản phẩm PCR Bảng 2.7. Thành phần phản ứng gắn 3’A Overhang STT Thành phần Thể tích (50µl) 1 Sản phẩm PCR (1 µg) 24 2 dATP (10 mM) 1