2.2.2.1. Chuẩn bị vật liệu cho tổng hợp cDNA
Hạt ngô sau khi khử trùng được nảy mầm trên giấy thấm 7 – 8 ngày ở 26oC trong điều kiện 16 giờ sáng và 8 giờ tối. Sau khi nảy mầm 7 – 8 ngày các cây ngô được xử lý với sorbitol nồng độ 0.2M ở 26oC với các thời gian khác nhau. Mẫu được thu ở các thời điểm khác nhau: 0 giờ, 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ, và 24 giờ sau khi xử lý với sorbitol, sau đó cho ngay mẫu vào nitơ lỏng. Tiếp theo sẽ tiến hành tách chiết RNA tổng số với hóa chất Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Tiếp đó tiến hành xử lý RNA tổng số với DNase để loại bỏ DNA và được sử dụng làm vật liệu để tổng hợp cDNA sợi đơn.
2.2.2.2. Quy trình tách chiết RNA tổng số từ mẫu ngô
Sau khi thu mẫu ngô, tiến hành tách chiết RNA tổng số theo quy trình sau:
- Nghiền 100 mg mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ cho đến khi thành bột mịn. Chuyển nhanh mẫu sang ống eppendorf 2ml.
- Bổ sung ngay 1ml hóa chất Trizol và vortex trong 1 phút.
- Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 0.2 ml Chloroform và vortex khoảng 1 phút.
- Ủ 2-3 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 13000 rpm ở 4oC, 15 phút.
- Chuyển dịch pha trên sang ống eppendorf mới (RNase-free).
- Bổ sung isopropanol (RNase-free) tỷ lệ 1:1 với mẫu và đảo đều sau đó đặt trong tủ -20oC, 2 giờ.
- Li tâm 13000 rpm ở 4oC, 15 phút.
- Li tâm 13000 rpm ở 4oC, 15 phút.
- Làm khô RNA ở nhiệt độ phòng.
- Hòa tan RNA trong nước (RNase-free) và giữ ở tủ -20oC.
2.2.2.3. Phương pháp khử DNA Bảng 2.2. Thành phần phản ứng STT Thành phần Thể tích (µl) 1 10X Buffer 3 2 DNase 1,5 3 RNA tổng số 3 4 H2O (RNase-free) 22,5 5 Tổng 30 Quy trình: - Ủ hỗn hợp trên ở 37oC trong 30 phút.
- Bổ sung 6 µl hóa chất Inactivation.
- Để nhiệt độ phòng 2 phút, lắc nhẹ nhàng.
- Ly tâm 13000 ở 4o
C khoảng 1,5 phút.
- Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới.
- Kiểm tra độ tinh sạch và chất lượng DNA bằng điện di và đo nồng độ DNA bằng máy nanodrop.
- Lưu giữ ở tủ -80oC.
2.2.2.4. Phương pháp tổng hợp cDNA sợi đơn
RNA tổng số được sử dụng để nhân gen bằng phương pháp tổng hợp cDNA của hãng Invitrogen theo quy trình sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng STT Thành phần Thể tích (µl) 1 RNA tổng số 4 2 Primer* 50µM oligo (dT)20 1 3 dNTP mix (10 mM) 1 4 DEPC-treated water 4 5 Tổng 10 - Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (bảng 2.3). - Ủ ở 65o
C trong 5 phút, sau đó đặt ngay lên đá ít nhất 1 phút.
- Chuẩn bị phản ứng tổng hợp cDNA theo thành phần bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA STT Thành phần Thể tích (10 µl) 1 Buffer (10X) 2 2 MgCl 2 (25mM) 4 3 DTT (0,1 M) 2 4 RNaseOUTTM (40 U/µl) 1 5 SuperScriptTM III RT (200U/µl) 1
- Bổ sung 10µl thành phần phản ứng tổng hợp cDNA (bảng 2.4) vào ống thành phần (bảng 2.3) mix và ly tâm nhẹ nhàng. Ủ ở 50oC trong 50 phút.
- Ly tâm nhẹ nhàng. Bổ sung 1 µl RNaseH hỗn hợp và ủ ở 37oC trong 20 phút.
- Phản ứng tổng hợp cDNA có thể được lưu giữ ở tủ -20oC hoặc sử dụng cho phản ứng PCR ngay lập tức.