RNA tổng số được tách chiết từ các mẫu thu lúc: 0 giờ, 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ sau khi xử lý sorbitol 0,2M tương ứng là: RNA-0h, RNA-1h, RNA-6h, RNA-12h và RNA-24h. Mẫu RNA xử lý hạn với sorbitol lúc 1 giờ sau khi tổng hợp cDNA được chúng tôi sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen ZmN-YB2. Các mẫu RNA xử lý ở các thời gian khác nhau ở trên được sử dụng làm vật liệu cho phản ứng RT-PCR để tạo các cDNA tương ứng là: cDNA-0h, cDNA-1h, cDNA-6h, cDNA-12h và cDNA-24h được chúng tôi sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen ZmNAC1.
Dựa vào trình tự nucleotide của gen ZmNF-YB2 được công bố trên ngân hàng gen có mã số (gb|DQ333304.1|), chúng tôi đã tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu ZmNfyb2Asc-F/ZmNfyb2Asc-R (bảng 2.1) để khuếch đại trình tự nucleotide chứa phần mã hóa gen ZmNF-YB2. Trình tự mồi ZmNfyb2Asc-F có chứa trình tự nhận biết của
enzyme giới hạn AscI và 20 nucleotide ở vùng mã hóa gen đầu 5’ từ bộ ba khởi đầu dịch mã (ATG). Mồi ZmNfyb2Asc-R chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn AscI và 24 nucleotide ở vùng mã hóa gen đầu 3’ bắt đầu từ bộ ba kết thúc dịch mã (TTA). Để tiến hành phân lập đoạn gen ZmNAC1 từ giống ngô tẻ cao bằng NTCB, chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu ZmNAC1BamHI-F/ZmNAC1BamHI-R (bảng 2.1) nhằm khuếch đại phần mã hóa gen ZmNAC1 bằng phản ứng PCR. Mồi ZmNAC1BamHI-F có trình tự nhận biết của enzyme giới hạn BamHI và 20 nucleotide ở vùng mã hóa đầu 5’ từ bộ ba khởi đầu (ATG). Mồi ZmNAC1BamHI-R có trình tự BamHI và 24 nucleotide mã hóa ở đầu 3’ từ bộ ba kết thúc (TAG). Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 sử dụng 1µl cDNA chịu hạn của giống NTCB làm sợi khuôn, 2 mM dNTPs, 5 Unit Phusion Taq DNA polymerase trong thể tích phản ứng 50µl, chu trình gia nhiệt đã được trình bày trong phần phương pháp.
Sản phẩm của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 được tiến hành điện di kiểm tra và thu được kết quả là một băng DNA đặc hiệu kích thước khoảng 565 bp, đúng với kích thước lý thuyết dự tính (hình 3.2).
Hình 3.2. Kết quả khuếch đại gen ZmNF-YB2 từ cDNA Chú thích: M. ladder 1kb plus; 1-2. cDNA-1h
Qua hình 3.2, chúng tôi thấy cả 2 sản phẩm PCR khuếch đại từ cDN-1h có kích thước đúng với dự kiến của ZmNF-YB2. Chúng tôi sử dụng để chuyển vào vector tách dòng pGEM – T easy.
Kết quả khuếch đại đoạn gen mã hóa gen ZmNAC1 từ các cDNA khác nhau sau đó được điện di kiểm tra và chúng tôi thu được kết quả như hình 3.3.a.
Hình 3.3.a. Kết quả PCR gen ZmNAC1 từ các cDNA; b. Kết quả PCR đoạn gen ZmNAC1 dự kiến sau khi xử lý với sorbitol 12 giờ
Ghi chú: M. Ladder 1kb plus; (-). H2O; 0h: cDNA-0 giờ; 1h: cDNA-1 giờ; 6h: cDNA-6
giờ;12h: cDNA-12 giờ; 24h: cDNA-24 giờ; cDNA-rễ; cDNA-lá; cDNA-thân
Qua hình 3.3.a, không thấy có sản phẩm khuếch đại khi sử dụng khuôn mẫu cDNA-0h và cDNA-1h. Với khuôn mẫu cDNA-6h, cDNA-12h và cDNA-24h chúng tôi nhận được sản phẩm khuếch đại khoảng 906 bp, đúng như kích thước dự kiến của gen
ZmNAC1, tuy nhiên trong 3 sản phẩm PCR đó thì chỉ có sản phẩm của khuôn mẫu cDNA-
12h cho thấy khả năng khuếch đại cao hơn cả.
Dựa vào kết quả khuếch đại gen ZmNAC1 từ cDNA của các mẫu xử lý với sorbitol ở các thời gian khác nhau. Chúng tôi đã tiếp tục làm thí nghiệm đánh giá sự biểu hiện của
gen ZmNAC1 thông qua việc khuếch đại gen ZmNAC1 từ các mẫu cDNA được tổng hợp trên cơ sở RNA tách chiết ở các phần khác nhau như rễ, đoạn thân và lá đã xử lý sorbitol 12 giờ bằng phản ứng PCR.
Kết quả PCR thu được sau khi khuếch đại gen ZmNAC1 với cặp mồi đặc hiệu ZmNAC1BamHI-F/ZmNAC1BamHI-R, chúng tôi thấy trong số 3 mẫu PCR, cho thấy mức độ biểu hiện ở các mẫu cDNA được tổng hợp từ các phần khác nhau là khác nhau. Trong các mẫu sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR thì chỉ có mẫu cDNA được tổng hợp từ RNA tách chiết ở rễ và lá cho kết quả dương tính với cặp ZmNAC1BamHI- F/ZmNAC1BamHI-R có băng DNA khuếch đại trùng với kích thước dự kiến của gen
ZmNAC1 khoảng 906 bp ( Mẫu 1 và 2, hình 3.3.b).
Theo nghiên cứu của Yu-Jun Hao và cs (2011), cũng chỉ ra rằng gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC cũng hoạt động mạnh ở các bộ phận khác nhau của cây khi bị các yếu tố bất lợi tác động [18]. Trong nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy gen ZmNAC1 biểu hiện ở rễ và lá còn thân không cho biểu hiện. Chính vì thế, trong thí nghiệm của chúng tôi, băng DNA từ mẫu rễ và lá (hình 3.3.b) có khả năng đúng là gen ZmNAC1 đã được tách chiết, do đó chúng tôi đã lựa chọn đoạn gen được khuếch đại từ cDNA ở rễ để tinh sạch và đưa vào vector tách dòng pGEM-T Easy.
Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 dự kiến từ cDNA-1h và đoạn gen
ZmNAC1 từ cDNA-12h ở rễ được tinh sạch và xử lý gắn đầu 3’A Overhang trước khi gắn
vào vector pGEM – T Easy đã mở vòng sẵn, chứa gen kháng kháng sinh Ampicillin, và gen chỉ thị X-gal (hình 2.1). Sau khi phản ứng đóng vòng, plasmid mang trình tự đoạn
gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 được biến nạp vào chủng tế bào khả biến E.coli DH5α và
được nuôi cấy trên môi trường có chứa kháng sinh Ampicillin ở 37oC qua đêm 16 giờ. Các khuẩn lạc E.coli DH5α mọc trên môi trường có chứa kháng sinh Ampicillin được kiểm tra bằng phản ứng PCR trực tiếp với khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu ZmNfyb2Asc-F/ZmNfyb2Asc-R cho đoạn gen ZmNF-YB2 và cặp mồi đặc hiệu ZmNAC1BamHI-F/ZmNAC1BamHI-R cho đoạn gen ZmNAC1 (bảng 2.1). Kết quả PCR được điện di kiểm tra (hình 3.4 a và b).
Hình 3.4.a. Kết quả điện điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ khuẩn lạc mang gen ZmNF-
YB2; b. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc mang gen ZmNAC1
Ghi chú: M. Ladder 1kb; (-). H2O; 1-5: khuẩn lạc
Kết quả hình 3.4.a, cho thấy 5 khuẩn lạc kiểm tra đều cho kết quả dương tính với cặp mồi đặc hiệu của gen ZmNF-YB2 và đúng với kích thước dự kiến ban đầu khuếch đại từ cDNA khoảng 565 bp. Qua hình 3.4.b, các khuẩn lạc cho kết quả dương tính với cặp mồi đặc hiệu gen ZmNAC1 có kích thước đúng với kết quả dự kiến khoảng 906 bp.
Từ kết quả PCR kiểm tra các khuẩn lạc chứa đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 của giống NTCB trong vector tách dòng pGEM – T Easy chúng tôi tiến hành tách chiết và tinh sạch DNA plasmid từ các khuẩn lạc dương tính và gửi đi giải trình tự. Để đọc trình tự đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1, chúng tôi đã sử dụng mồi T7 (bảng 2.1) để tiến hành giải trình tự.
Kết quả đã xác định được kích thước trình tự DNA của gen ZmNF-YB2 tách chiết từ giống ngô tẻ Cao Bằng (NTCB) có chiều dài 537 nucleotide và mã hóa cho 178 amino acid (được trình bày ở phụ lục 3).
Khi so sánh trình tự nucleotide của gen ZmNF-YB2 phân lập được với trình tự nucleotide ban đầu chúng tôi sử dụng để thiết kế cặp mồi đặc hiệu bằng phần mềm GeneStream align cũng như nucleotide blast trên NCBI, chúng tôi nhận thấy gen ZmNF-
YB2 phân lập được từ giống ngô địa phương “ngô tẻ Cao Bằng”của Việt Nam có tỷ lệ tương đồng với gen ZmNF-YB2 được phân lập từ giống ngô B73 của Mosanto (gb|DQ333304.1|) là 95%. Trình tự mã hóa amino acid của NF-YB2 thu được từ giống NTCB ngắn hơn 21 nucleotide so với gen ZmNF-YB2 của gb|DQ333304.1|. Đoạn trình tự này mã hóa cho 7 amino acid T I P A N G K (được trình bày ở phụ lục 4).
Như vậy, với trình tự nucleotide của gen ZmNF-YB2 được phân lập và tách chiết từ giống NTCB có độ mức độ tương đồng 95% với gb|DQ333304.1| hoàn toàn có thể sử dụng để thiết kế vector biểu hiện ở những bước tiếp theo.
Kết quả đọc trình tự của gen ZmNAC1 được phân lập từ giống NTCB, chúng tôi đã xác định được kích thước trình tự DNA của gen ZmNAC1 có chiều dài 882 nucleotide và mã hóa cho 293 amino acid (được trình bày ở phụ lục 5).
Khi tiến hành so sánh trình tự nucleotide và amino acid ZmNAC1 của giống NTCB
với trình tự gen ZmNAC1 có mã số |EU224278.1| trên ngân hàng Genebank chúng tôi thấy tỷ lệ tương đồng là 100% (phụ lục 6).
Ngoài ra, khi tiến hành phân tích trình tự axit amin của ZmNAC1 với trình tự axit amin của các nhân tố phiên mã OsNAC1 trên đối tượng Japonica (ABD52007.1) cho thấy sự tương đồng là 83%. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nhân tố phiên mã đã chứng minh: có rất nhiều gen mã hóa nhân tố phiên mã trong mỗi hệ gen (8-10%); các gen này có sự tương đồng cao về trình tự nucleotide, axit amin trong cùng một họ và cùng một nhân tố phiên mã ở các loài thực vật khác nhau; có sự tương đồng về chức năng của chức năng của các gen mã hóa các nhân tố trong việc tăng cường tính chống chịu với điều kiện hạn, lạnh, mặn và nhiệt độ cao [40]; [52]. Vì vậy, cùng một gen mã hóa nhân tố phiên mã có thể sử dụng để tăng tính chịu hạn trên nhiều đối tượng thực vật và cho các điều kiện ngoại cảnh bất lợi khác nhau như hạn, lạnh mặn…
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng chỉ ra rằng: ZmNAC1 mã hóa nhân tố phiên
mã ZmNAC1 đã được phân lập thành công từ giống NTCB hoạt động mạnh trong điều
khác nhau là khác nhau. Trong điều kiện xử lí hạn nhân tạo bằng sorbitol sau 12 giờ gen
ZmNAC1 hoạt động mạnh ở vùng rễ và lá của giống NTCB. Đây là cơ sở ban đầu hết sức
quan trọng trong quá trình nghiên cứu thiết kế vevtor siêu biểu hiện gen ZmNAC1 phục vụ công tác chọn tạo các giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường.