Các cây sau chuyển gen sống sót ngoài bầu đất sẽ được tách chiết DNA tổng số và PCR với cặp mồi Bar-F/Bar-R để kiểm tra cây mang gen chọn lọc Bar cho cả 2 gen chuyển ZmNF-YB2 và ZmNAC1. Bản thân gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 được phân lập từ cây ngô, do vậy chúng tôi sử dụng cặp mồi 35S-F/ZmNfyb2Asc-R và 35S- F/ZmNAC1BamHI-R để kiểm tra sự có mặt của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 trong các cây đã được biến nạp (kết quả được trình bày trong bảng 3.3).
Bảng 3.3. Kết quả phân tích các dòng ngô chuyển gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 thế hệ T0 của 3 dòng ngô sử dụng biến nạp
Vector biến nạp Dòng ngô Số cây sống sót khi đƣa ra đất Số cây sống sót đã tách ADN và phân tích PCR Kết quả PCR thế hệ T0 Số cây hữu thụ có kết quả PCR (+) gen đích (+) gen chỉ thị (Bar) (+) gen đích CaMV35S: :ZmNF-YB VH1 27 27 4 1 1 CM8 6 6 0 0 0 CH9 31 31 4 3 3 Tổng số 64 64 8 4 4 CaMV35S: :ZmNAC1 VH1 18 18 6 0 0 CM8 12 12 0 0 0 CH9 20 20 3 0 0
Tổng số 50 50 9 0 0
Hình 3.10. Kết quả phân tích PCR gen chọn lọc (Bar) của các cây ngô chuyển genZmNF- YB2 thế hệ To
Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR gen đích ZmNF-YB2 của các cây ngô chuyển gen thế hệ To
Kết quả PCR kiểm tra các cây ngô được biến nạp gen ZmNF-YB2 với cặp mồi gen chọn lọc (Bar) và gen đích ZmNF-YB2 cho thấy, trong 64 cây có 8 cây trong 2 dòng VH1 và CH9 cho kết quả dương tính với gen chỉ thị Bar, có 4 mẫu dương tính với gen đích
ZmNF-YB2. Cả 4 cây này đều hữu thụ gồm: 1 cây thuộc dòng VH1 và 3 cây thuộc dòng
Qua kết quả này, chúng tôi nhận thấy dòng ngô CH9 có khả năng tiếp nhận vector
pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 tốt hơn so với 2 dòng ngô VH1 và CM8.
Hình 3.12. Kết quả phân tích PCR gen chọn lọc (Bar) của các cây ngô chuyển gen ZmNAC1 thế hệ To
Kết quả phân tích PCR các cây ngô chuyển gen được biến nạp gen ZmNAC1 với cặp mồi đặc hiệu gen Bar cho thấy, trong 50 mẫu DNA của 3 dòng ngô thí nghiệm có 6 mẫu thuộc dòng VH1 và 3 mẫu thuộc dòng CH9 cho kết quả dương tính với cặp mồi gen chỉ thị (Bar) (hình 3.12). Tuy nhiên, do thời gian không cho phép nên chúng tôi chưa thể tiến hành kiểm tra PCR gen đích ZmNAC1 của các dòng ngô đã biến nạp.
Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và
ZmNAC1 được điều khiển bởi promoter 35S và thu được một số kết quả khả quan khi
khảo sát khả năng tiếp nhận gen của 3 dòng ngô chọn lọc với gen ZmNF-YB2. Tuy nhiên, kết quả biến nạp gen ZmNAC1 vào các dòng ngô Việt Nam mới chỉ kiểm tra được ở kết quả mang gen chọn lọc, chưa có thời gian để kiểm tra với gen ZmNAC1. Chúng tôi hy vọng sẽ sớm kiểm tra được các cây biến nạp gen ZmNAC1 với cặp mồi đặc hiểu để có thể kịp bổ sung vào luận án.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
1. Tách dòng thành công đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 thuộc nhóm nhân tố phiên mã có khả năng nâng cao khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán từ giống ngô tẻ Cao Bằng. Kết quả tách dòng cho thấy gen ZmNF-YB2 có 537 nucleotide mã hóa cho 178 amino acid, gen ZmNAC1 có 882 nucleotide mã hóa cho 293 amino acid. 2. Thiết kế thành công vector siêu biểu hiện có chứa đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1
dưới sự điều khiển của promoter 35S.
3. Kết quả phân tích PCR của các dòng ngô sau khi biến nap đã chứng tổ rằng tổ hợp vector siêu biểu hiện pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 và pZY:CaMV35S:ZmNAC1 có thể sử dụng để chuyển gen vào các dòng ngô chọ lọc của Việt Nam.
II. KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu quy trình biến nạp ngô nhằm nâng cao hiệu quả chuyển gen
ZmNF-YB2 và ZmNAC1 vào các dòng ngô Việt Nam.
2. Tiếp tục phân tích đánh giá cây sau chuyển gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 ở thế hệ tiếp theo bằng các kỹ thuật PCR, Southern blot…
3. Từ kết quả thu được cây chuyển gen, tiếp tục nghiên cứu đánh giá sự biểu hiện của các gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 ở các điều kiện hạn hán khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TRONG NƢỚC
1. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Phạm Thị Hương, Lê Thị Thu Về, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Lê Huy Hàm (2013), Nghiên cứu biến nạp gen kháng hạn vào một số dòng ngô chọn lọc thông qua vi khuẩn Agrobacterium.
Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 2(41): 61-67.
2. Lê Thị Thu Hiền và cộng sự (2003),Cây trồng biến đổi di truyền: thực trạng và triển vọng, Công nghệ sinh học, 1(3): 265-285.
3. Nguyễn Hữu Hoàng (2009), Giá trị dinh dưỡng của ngô, Viện Khoa học Nông
nghiệp Việt Nam.
4. Nguyễn Thị Thanh và cộng sự (1999), Tạo cây cải bông (Brassica oleracea var
botrycis) và cây cải xanh (B. juncea) mang gen kháng sâu cry1ac và gen bar kháng
thuốc cỏ dại thông qua A. tumefaciens, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh
học toàn quốc: 1121-1128.
5. Phạm Thị Lý Thu (2007), Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ở ngô. Luận án Tiến Sĩ sinh học, Viện Công
nghệ Sinh học.
6. Ngô Hữu Tình (2009), Chọn lọc và lai tạo giống ngô, Nxb Nông nghiệp.
7. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2007), Công nghệ sinh học tập năm công nghệ vi sinh và môi trường, Nxb Giáo dục.
8. Vũ Văn Vụ (1996), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo Dục.
TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI
9. Aida M., Ishida T., Fukaki H., Fujisawa H., & Tasaka M. (1997), Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant,
Plant Cell, 9:841-857.
10. Boyer J.S. (1982), Plant productivity and environment, Science, 218:443-448. 11. Cook E. R., Seager R., Cane M. A., Stahle D.W. (2007), Earth, Sci Rev, 81:93-134.
12. Collinge M., & Boller T. (2001), Differential induction of two potato genes, Stprx2
and StNAC, in response to infection by Phytophthora infestans and to wounding,
Plant Mol Biol, 46(5):521e9.
13. Cutler S. R., Rodriguez P. L., Finkelstein R. R., Abrams S. R. (2010), Abscisic acid: emergence of acoresignaling network”, Annual Reviewof Plant
Biology, 61:651-679.
14.Edmeades O. G. (2007), Drought tolerance in Maize: An Emerging Reality. Companion document to excutive summary, ISAAA briefs: 39-2008.
15. Fang Y., You J., Xie K., Xie W., Xiong L. (2008), Systematic sequence analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice, Mol Genet Genomics, 280:535-46.
16. Gusmaroli G., Tonelli C., Mantovani R. (2001), Regulation of the CCAAT-binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana, Gene, 264:173-185.
17. Hankenberg D., Wu Y., Voigt A., Adams R., Schramm P., Grimm B. (2011), Studies on differential nuclear translocation mechanism and assembly of the three subunits of the arabidopsis thaliana transcription factor NF-Y, Mol. Plant, doi: 10.1093/mp/ssr107.
18. Hao Y. J., Wei W., Song Q. X., Chen H. W., Zhang Y. Q., Wang F., Zou H. F., Lei G., Tian A. G., Zhang W. K., Ma B., Zhang J. S., Chen S. Y. (2011), Soybean NAC transcription factor promote abiotic stress tolerance and lateral root formation in transgenic plants, The Plant Journal, 68:302-313.
19. Hu H., Dai M., Yao J., Xiao B., Li X., Zhang Q., et al. (2006), Overexpressing a NAM, ATAF and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice, Proc Natl Acad Sci USA, 103(129):87-92.
20. Huang T., Duman J. G. (2002), Cloning and characterization of a thermal hysteresis (antifreeze) protein with DNA-binding activity from winter bittersweet nightshade, Solanum dulcamara, Plant Mol Biol, 48:339-50.
22. Ishiguro S., & Nakamura K. (1994), Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein, SPF1, that recognizes SP8 sequences in the 5, upstream regions of genes coding for sporamin and b-amylase from sweet potato, Mol Genet
Genomics, 244:563-571.
23. James, C. (2013), Global status of commercialized biotech/GM crops: 2013, ISAAA:
Ithaca, NY.
24. Katia P., Roderick W. K., Nerina G., Valentina C., Monica F., Chiara T., Ben F. H., Roberto M. (2012), The promiscuous life of plant nuclear factor Y transcription factors, The Plant Cell, 24: 4777-4792.
25. Kazuo N., Kazuko Y. S. (2005), Molecular studies on stress-responsive gene expression in Arabidopsis and improvement of stress tolerance in crop plants by regulon biotechnology, JARQ39 (4): 221-229.
26. Kim T. H., Bohmer M., Hu H., Nishimura N., Schroeder J. I. (2010), Guard cell Signal transduction network: Advances in understanding abscisis acid, CO1, and Ca2+ signaling, Annu Rev Plant Biol, 61:561-591.
27. Kumimoto R. W., Zhang Y., Siefers N., Holt B. F. (2010), NF-YC3, NF-YC4 and NF-YC9 are required for constants-mediated, photoperiod-dependent flowering in Arabidopsis thaliana, Plant J, 63:379-391.
28. Kizis D., Pages M. (2002), Maize DRE-binding proteins DBF1 and DBF2 are involved in rab17 regulation through the drought-responsive element in an ABA- dependent pathway, Plant J, 30:679-689.
29. Le D. T., Nishiyama R., Watanabe Y., Mochida K., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Tran L. S. P. (2011), Genome-wide survey and expression analysis of the plant-specific NAC transcription factor family in soybean during development and dehydration stress, DNA Research, 18:263-276.
30. Li W. X., Oono Y., Zhu J., He X. J., Wu J. M., Lida K., Lu X. Y., Cui X., Jin H., Zhu J. K. (2010), The Arabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally and postranscriptionally to promote drought resistance, The Plant
31. Liu J.X., Howell S.H. (2010), bZIP28 and NF-Y transcription factors are activated by ER stress and assemble into a transcriptional complex to regulate stress response genes in Arabidopsis, Plant Cell, 22:782-796.
32. Lu M., Ying S., Zhang D. F., Shi Y. S., Song Y. C., Tian Y., Li Y. (2012), A maize stress-responsive NAC transcription factor, ZmNAC1, confers enhanced tolerance to dehydration in transgenic Arabidopsis”, Plant Cell Reports, 31(9):1701.
33. Maity S.N., Crombrugghe B. D. (1998), Role of the CCAAT-binding protein CBF/NF-Y in transcription, Trends Biochem Sci, 23:174-178.
34.Manuela M. C., João P. M., João S. P. (2003), Understanding plant response to drought from genes to the whole plant, Functional Plant Biology, 30:239-264.
35. Masiero S., Imbriano C., Ravasio F., Favaro R., Pelucchi N., Gorla M. S., Mantovani R., Colombo L., Kater M. M. (2002), Ternary complex formation between MADS-box transcription factors and the histone fold protein NF-YB,
J.Biol. Chem, 277(22):6529-26435.
36. Mochida K., Yoshida T., Sakurai T., Yamaguchi- Shinozaki K., Shinozaki K., Tran L-S.P. (2009), In silico analysis of transcription factor repertoire and prediction of stress responsive transcription factors in soybean, DNA Res.
37. Mohammed N., Akhter M. S., Shoshi K., (2013), Roles of NAC transcription factors in the regulation of biotic and abiotic stress responses in plants, Microbiology 4:doi 10.3389/fmicb.
38. Nakashima K., Takasaki H., Mizoi J., Shinozaki K., & Yamaguchi-shinozaki K. (2012), NAC transcription factors in plant abiotic stress responses, Biochimica et
Biophysica Acta, 1819:97-103.
39. Nakashima K., Ito Y., & Yamaguchi-shinozaki K. (2009), Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and grasses, Plant Physiol, 149:88-95.
40. Nakashima K., Tran L. P., Nguyen D. V., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., et al. (2007), Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress responsive gene expression in rice, Plant J, 51:617e30.
41. Nelson D. E., Repetti P. P., Adams T. R., Creelman R. A., Wu J., Warney D. C., Anstrom D. C., Bensen R. J., Castiglioni P. P., Donnarummo M. G., HinChey B. S., Kumimoto R. W., Maszle D. R., Canales R. D., Krolikowski K. A., Dotson S. B., Gutterson N., Ratcliffe O. J., Heard J. E. (2007), Plant nucleare factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limted acres, Pnas, 104:16450-16455.
42. Ooka H., Satoh K., Doi K., Nagata T., Otomo Y., Murakami K. (2003), Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana, DNA Res, 20:239-247.
43. Petit J. R., Jouzel J., Raynaud D., Barkov N. I., Barnola J. M., Basile I., Bender M., Chappellaz J., Davis M., Delaygue G., Delmotte M., Kotlyakov V. M., Legrand M., Lipenkov V. Y., Lorius C., Pespin L., Ritz C., Saltzman E., Stivernard M. (2009), Climate and atmospheric history of the past 420,000 years from the Vostok ice core, Antarctica, Nature, 399:429-436.
44.Pingali P. L., Pandey S. (2001), World maize needs meeting: technological opportunities and priorities for the public section, Pingali P (ed) CIMMYT 1999- 2000. World maize facts and trends. Meeting world maize needs: technological opportunities and priorities for the public section.CIMMYT, Mexico city: 1-3.
45. Riechmann J. L., Heard J., Martin G., Reuber L., Jiang C. Z., Keddie J., Adam L., Pineda O., Racliffe O. J., Samaha R. R. (2000), Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes, Science, 290: 2105-2110. 46.Rivero M. R, Kojima M., Gepstein A., Sakakibara H., Mittler R., Gepstein S.,
Blumwald E. (2007), Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowering plant, PNAS, 104(49):19631-19636.
47. Roderick W. K., Chamindika L. S., Krystal K. G., Jan R. R., Nicholas S., Ben F. H. (2013), Nuclear factor Y transcription factors have both opposing and additive roles in ABA-mediated seed germination, PLoS ONE, 8(3):e59841.
48. Rushton P. J., Bokowiec M. T., Han S., Zhang H., Brannock J. F., Chen X., et al. (2008), Tobacco transcription factors: novel insights into transcriptional regulation in the Solanaceae, Plant Physiol.
49. Saibo N. J. M., Lourenco T., Oliveira M. M. (2009), Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses,
Annals of Botany, 103: 609-623.
50. Salinger M. J, Sivakumar M. V. K., Motha R. (2005), Climatic, Change, 70:341–362. 51. Schmutz J., Steven B. C., Jessica S., Jianxin M., Therese M., Nelson W., David L. H., Qijian S., Jay J. T., Jianlin C., Xu D., Hellsten U., May G. D., Yu Y., Sakurai T., Umezawa T., Bhattacharyya M. K., Sandhu D., Valliyodan B., Lindquist E., Peto M., Grant D., Shu S., Goodstein D., Barry K., Montona F. G., Abernathy B., Jianchang D., Zhixi T., Liucun Z., Navdeep G., Trupti J., Marc L., Anand S., Zhang X. C., Shinozaki K., Nguyen H. T., Wing R. A., Cregan P., Specht J., Grimwood J., Rokhsar D., Stacey G., Shoemaker R. C., Jackson S. A. (2010), Genome sequence of the palaeopolyploid soybean, Nature, 463:178-183.
52. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2007), Gene networks involved in drought stress response and tolerance, J Exp Bot, 58:221-227.
53. Siefers N., Dang K. K., Kumimoto R. W., Bynum W. E. T., Tayrose G., Holt B. F. (2009), Tissue-specific expression patterns of Arabidopsis NF-Y transcription factors suggest potential for extensive combinatorial complexity, Plant Physiol,
149:625-641.
54. Sinha S., Maity S. N., Lu J., de Crombrugghe B. (1995), Recombinant rat CBF-C, the third subunit of CBF/NFY, allows formation of a protein-DNA complex with CBF-A and CBF-B and with yeast HAP2 and HAP3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1624-1628.
55. Tiwari S. B., Shen Y., Chang H. C., Hou Y., Harris A., Ma S. F., McPartland M., Hymus G. J., Adam L., Marion C., Belachew A., Repetti P. P., Reuber T. L., Ratcliffe O. J. (2010), The flowering time regulator constans is recruited to the flowering locus T promoter via a unique cis-element, New Phytol, 187:56-66.
56. Tran L.S., Nishiyama R., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2010), Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress tolerance in plants by biotechnological approach, GM Crops, 1(1):32-39.
57. Udvardi M. K., Kakar K., Wandrey M., Montanari O., Murray J., Andriankaja A., Zhang J. Y., Benedito V., Hofer J. M. I., Chueng F., et al. (2007), Legume transcription factors: global regulators of plant development and response to the environment, Plant Physiol, 144: 538-549.
58. Umezawa T., Nakashima K., Miyakawa T., Kuromori T., Tanokura M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2010), Molecular basis of the core regulatory network in ABA responses: Sensing, Signaling and transport, Plant Cell Physiol, 51(11):1821-1839.
59. Vavilov N.I. (1926), Studies on the Conbining Ability of CIMMYT Germplasm,
CIMMYT Research Highlights: 24-33.
60. Wang Y, Ying J., Kuzma M. , Chalifoux M., Sample A., Arthur M. C., Uchacz T., Sarvas C., Wan J., Dennis T. D. , Court M. P., Huang Y. (2005), Molecular tailoring of farnesylation for plant drought tolerance and yield protection, The Plant Journal,
43:413-424.
61. Xia N., Zhang G., Sun Y. F., Zhu L., Xu L. S., Chen X. M., Liu. B., Yu Y. T., Wang X. J., Huang L. L., & Kang Z. S. (2010), TaNAC8, a novel NAC transcription factor gene in wheat, responds to stripe rust pathogen infection and abiotic stresses,
Physiol. Mol.Plant Pathol, 74: 394e402.
62. Xiao H., Sha T., Yi A., Dong-Chao Z., Xin-Li X., Wie-Lun Y. (2013),