Tại Việt Nam, kể từ ca thay van tim nhân tạo đầu tiên được thực hiện tại Bệnh viện Việt Đức vào năm 1979, cho đến nay, mỗi năm có hàng ngàn bệnh nhân được thay van tim tại nhiều bệnh viện/trung tâm tim mạch trên cả nước. Tại Bệnh viện Tim Hà Nội, trong thời gian từ tháng 01/2006 đến tháng 12/2007 đã có 1.335 bệnh nhân được thay van tim. Tại trung tâm Tim mạch Bệnh viện E, hàng năm thay van tim cho khoảng 1.000 bệnh nhân. Viện Tim mạch Bệnh viện Bạch Mai cũng thực hiện gần 1.000 ca thay van tim mỗi năm. Cũng giống như tại các nước trên thế giới, bệnh nhân sau khi thay van tim tại các trung tâm tim mạch của Việt Nam thường gặp nhiều các biến chứng sau thay van tim như kẹt van tim, hư van, nhưng phổ biến và nguy hiểm nhất là huyết khối, tắc mạch do các cục máu đông hình thành trong quá trình hoạt động van tim nhân tạo [5][7].
Năm 2008, Hội tim mạch học Việt Nam đã đưa ra khuyến các về chuẩn đoán và điều trị các bệnh van tim đã đưa ra các chỉ định điều trị ngoại khoa các bệnh van tim cũng như chiến lược điều trị sau thay van tim [6]. Để hạn chế biến chứng của bệnh nhân sau phẫu thuật thay van tim bệnh nhân bắt buộc phải sử dụng thuốc chống đông máu cả đời. Tại các trung tâm tim mạch của Việt Nam, thuốc chống đông máu nhóm AVK thường được sử dụng hiện nay có 2 loại: warfarin (Coumadin 2 mg) và acenocoumarol (Sintrom 4 mg). Tuy nhiên, acenocoumarol được dùng phổ biến hơn (ngoài sự lựa chọn của bệnh nhân và thầy thuốc còn do chế độ Bảo hiểm y
tế). Do khoảng an toàn của thuốc chống đông máu nhóm AVK rất hẹp, nên khi điều trị phải dò liều an toàn, đảm bảo đạt hiệu lực nhưng tránh được biến chứng chảy máu do quá liều vì vậy bệnh nhân phải theo dõi chỉ số INR thường xuyên để điều chỉnh liều dưới sự tư vấn của bác sĩ [30][50].
Tuy nhiên, hiện nay tỉ lệ bệnh nhân được theo dõi và INR đạt đích điều trị chỉ có 21 - 44,8%. Nguyễn Quốc Kính và Tạ Mạnh Cường (2011) nghiên cứu trên 200 bệnh nhân thay van tim cơ học tại Bệnh viện Tim Hà Nội thấy có 5 bệnh nhân tử vong, 8 bệnh nhân kẹt van và 5 - 7,5% bệnh nhân bị huyết khối, 18 - 23,6% bệnh nhân có biến chứng chảy máu, tỉ lệ đạt đích INR chuẩn hóa (INR: 2,5 - 3,5) chỉ đạt 30 - 33%. Việc hướng dẫn dùng thuốc chống đông chưa được tốt với 27,3% bệnh nhân cho là không cần xét nghiệm đông máu và có tới 21,8% bệnh nhân không biết cần điều chỉnh liều thuốc chống đông theo giá trị INR. Chỉ có 67,3% bệnh nhân ý thức được phạm vi đích điều trị INR nhưng 10% trong số đó hiểu sai giá trị đích INR [8].
Nghiên cứu của Hồ Thị Thiên Nga (2009) tại bệnh viện Việt Đức, trong số 180 bệnh nhân thì 40% không biết đích INR cần đạt [10]. Hoàng Quốc Toàn và cs (2010) nghiên cứu trên 168 bệnh nhân sau thay van tim tại bệnh viện 108: có 60,1% bệnh nhân thay van hai lá và 25,6% thay van hai lá và van động mạch chủ. Liều Sintrom cho bệnh nhân sau thay van từ 1/8 đến ¾ viên/ngày, trong đó có 42,9% bệnh nhân dùng liều 3/8 viên và 29,8% bệnh nhân dùng liều ¼ và 3/8 viên xen k . Tác giả gặp: 20,2% bệnh nhân có biến chứng liên quan đến thuốc chống đông sau thay van tim trong đó xuất huyết là 19% và huyết khối gây kẹt van là 1,2%, vị trí xuất huyết nhiều nhất là xuất huyết dưới da (31,3%), chảy máu mũi miệng (37,5%) và có 12,5% xuất huyết não. Yếu tố liên quan đến biến chứng do thuốc chống đông là: bệnh nhân không uống thuốc thường xuyên và không kiểm tra định kì (đánh giá INR) [11].
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
- Bệnh nhân mắc bệnh van tim có chỉ định thay van tim:
+ Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân theo khuyến cáo của Hội Tim mạch học Việt Nam [6] và hướng dẫn điều trị bệnh van tim của Hội Tim mạch Hoa Kỳ [18].
+ Hồ sơ bệnh nhân gồm: lối sống và tiền sử dùng thuốc. Thông tin thu thập bao gồm: các chỉ định điều trị, điều kiện kèm theo, loại thuốc, các hoạt động thể chất và đặc biệt là khẩu phần ăn các loại thực phẩm giàu vitamin K trong 1 tuần.
+ Chỉ số đông máu INR được duy trì trong khoảng giới hạn mong muốn để đạt được liều điều trị acenocoumarol.
- Kiểm tra khi tái khám:
+ Lâm sàng: kiểm tra xem bệnh nhân có triệu chứng quá liều hoặc chưa đạt liều hay không.
+ Cận lâm sàng: cho bệnh nhân kiểm tra chỉ số INR. Khi INR nằm trong giới hạn mong muốn tức là đã “đạt liều” thuốc chống đông.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Bệnh nhân đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng. - Bệnh nhân huyết động không ổn định.
- Bệnh nhân tai biến mạch não dưới 3 tháng. - Bệnh nhân mới phẫu thuật dưới 1 tuần. - Bệnh nhân suy thận, suy gan giai đoạn cuối. - Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2017 đến tháng 2/2018. - Địa điểm lấy mẫu: Bệnh viện Tim Hà Nội.
- Địa điểm nghiên cứu:
+ Bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội + Bệnh viện Tim Hà Nội
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang.
- Cỡ mẫu nghiên cứu: trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện. Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn liên tiếp, thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân (mục 2.1.1) tại địa điểm được chọn là Bệnh viện Tim Hà Nội. Những bệnh nhân này tự nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu.
Số luợng bẹnh nhân tối thiểu cần cho nghiên cứu đuợc xác định bằng côngthức:
n: số bẹnh nhân tối thiểu cần đạt đuợc. Z1-α/2 = 1,96.
p: tỷ lẹ tối thiểu phát hiẹn ra đọt biến gen khoảng 7% d: hẹ số ảnh huởng 0,05
Thay số vào ta có tổng cỡ mẫu n 100 bẹ nh nhân. Như vậy, ta có tổng số mẫu cho nghiên cứu là 100.
2.3. Nguyên liệu và phƣơng tiện nghiên cứu
2.3.1. Hóa chất
- Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT- Mỹ.
- Lambda DNA/HindIII Marker, code: SM0103, hãng: Fermentas. - 6 X DNA loading dye, code: R0611, hãng: Thermo Scientific. - GeneRuler: Marker 100-4 kb Plus DNA (Lonza).
- dNTPs 2 mM each, code: R0241, hãng: Thermo Scientific.
- Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) code:15701500GM, Affymetrix. - Nước khử ion (DDW), code: 16500100, hãng: Invitrogen.
n = Z21-α/2 p(1-p)
- Tris base, code: TB0196, hãng: Bio basic. - Acid acetic, code: 100056, hãng: Merck.
- Phusion DNA polymerase, hãng: Neb (New England Biolabs). - E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code : D3392, hãng: Omega-Biotek. - GeneJET PCR Kit, hãng: Thermo Fisher Scientific.
2.3.2. Thiết bị
- Máy PCR Prime Thermal Cycler (code: 5PRIME/02, Anh).
- Máy khuếch đại DNA có gradient nhiệt, Mastercycler pro S, Eppendorf , Đức. - Máy ly tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen, Code: D78532, Đức.
-Tủ an toàn sinh học cấp II, Model: AC2-4E8, ESCO 2016-113443, Indonesia. - Máy quang phổ thể tích nano, Nano Photometer-implen NP80, Đức.
- Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ.
- Tủ ấm (Lab.Incubator, Digisystem Laboratory Instruments Inc.), Đài Loan. - Hệ thống điện di MultiSub Choice, Cleaver Scientific, Bỉ.
- Máy chụp ảnh gel và xử lý hình ảnh điện di có màn hình, GelDoc-it2-UVP, Mỹ. - Tủ lạnh lưu mẫu sinh phẩm -300C, MDF-U334, Nhật.
- Máy cô DNA, Model: CVE2200, Nhật Bản.
2.3.3. Dụng cụ
- Pipet eppendoft từ 2,5 - 1000 µl. - Đầu côn sử dụng cho các pipet. - Ống fancol 15 ml.
- Ống eppendoft loại 1,5 ml và 2 ml. - Ống PCR 0,2 ml.
2.3.4. Mẫu nghiên cứu
- Mẫu máu bệnh nhân được bảo quản trong chất chống đông EDTA ở -300C. - Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm.
2.4. Các bƣớc nghiên cứu
2.4.1. Quy trình nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được chúng tôi thực hiện như sơ đồ thể hiện dưới đây
Bệnh nhân thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn
Mẫu máu của bệnh nhân/EDTA
Tách DNA tổng số
Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3, SNP rs9923231 trên gen VKORC1 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương
pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu
Tinh sạch sản phẩm PCR
Xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3
bằng phương pháp giải trình tự gen
Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 trên
gen VKORC1 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1 bằng phương pháp RFLP có đối
chiếu kết quả với phương pháp giải trình tự gen ở 20 mẫu bệnh nhân đầu
Xác định tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP
CYP2C9*3, SNP rs9923231 trên gen VKORC1 và
2.4.2. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu
- Cách lấy mẫu: 2 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chứa vào ống chuyên dụng chứa sẵn chất chống đông EDTA. Đảm bảo mẫu không bị nhiễm bẩn và không bị lẫn các mẫu với nhau, ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và mã code. Mỗi ống máu phải đủ cho nhiều hơn 1 lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu và có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định được kiểu gen của bệnh nhân.
- Cách bảo quản: tại địa điểm thu nhận, mẫu được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ từ -200C đến -300C không quá 1 ngày, sau đó được vận chuyển đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Mẫu được bảo quản ở -300C cho đến khi dùng.
- Kí hiệu mẫu: ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin: mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu, đánh dấu số thứ tự mẫu nghiên cứu. Thông tin về mẫu máu của bệnh nhân phải được lưu trong sổ với các thông tin: tên, tuổi, số giường và phòng điều trị, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.
2.4.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số
2.4.3.1. Tách chiết DNA tổng số
- Nguyên lý: sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số. Nguyên lý của kit này dựa trên sự hấp thụ chọn lọc của các acid nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải phóng DNA; DNA liên kết với màng silica-gel; Loại bỏ tạp chất trên màng silica- gel với Wash Buffer; Thu nhận DNA. Trước khi tách, lấy mẫu giã đông từ từ trên đá hoặc trong tủ mát. Khi mẫu đã giã đông hoàn toàn mới được sử dụng để tiến hành tách DNA tổng số.
-Quy trình tách DNA tổng số bằng kit E.Z.N.A blood DNA Mini Kit: 1. Lắc đều ống máu. Chuyển 250 µl mẫu vào ống epp 1,5 ml vô trùng. 2. Thêm 25 µl OB Protease Solution và 250 µl BL Buffer. Vortex 10 giây 3. Ủ 650C trong 10 phút. Chú ý: sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15s 4. Thêm 260 µl Ethanol 100%. Vortex trong 20 giây
5. Ly tâm 1000 v/p trong 15s để đảm bảo mẫu không dính trên thành ống Chú ý: Tất cả các bước ly tâm phải cân và đối trọng các mẫu ly tâm
6. Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 ml 7. Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µl)
8. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút 9. Bỏ dịch lọc và Collection Tube
10. Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 ml mới 11. Thêm 500 µl HBC Buffer
12. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút 13. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube 14. Thêm 700 µl DNA Wash Buffer
15. Ly tâm trong 14.000 vòng/phút trong 1 phút 16. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube
17. Lặp lại các bước 14-16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer 18. Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 v/p trong 2 phút 19. Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2ml mới
20. Thêm 100 µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 650C). Ủ 650C, 5 phút. 21. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút
22. Thêm 50 µl Elution Buffer, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng 23. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút
24. Thu và bảo quản DNA ở -300C.
2.4.3.2. Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang
Các mẫu sau khi tách DNA tổng số đều được kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang ở bước sóng A260 nm và A280 nm để đánh giá nồng độ DNA và độ tinh sạch của DNA. Phương pháp này sử dụng máy đo quang phổ nồng độ nano, Nano Photometer-implen NP80. Quy trình thao tác chung gồm các bước sau:
- Đo Blank: đo với 2 µl môi trường dùng để bảo quản mẫu DNA tổng số. - Đo mẫu DNA: đo với 2 µl mẫu DNA tổng số vừa thu được.
Mỗi mẫu phải đo ít nhất 2 lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu.
2.4.4. Trình tự mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Trình tự các cặp mồi được tham chiếu trên ngân hàng gen NCBI và đặt tổng hợp từ hãng IDT-Mỹ. Trình tự mồi xuôi và ngược như sau:
Bảng 2.1. Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen chứa các alen
Alen Mồi Trình tự Kích thƣớc (bp) CYP2C9*3 rs1057910-F GCATCTGTAACCATCCTCTC 719 rs1057910-R GTGTCAAGATTCAGTTCTTTCC rs9923231 rs9923231-F TACAACTCCCATCATGCCTG 771 rs9923231-R GACCATCGTCAATCTCTACC rs9934438 rs9934438-F GGTGCCTTAATCCCAGCTACTC 714 rs9934438-R AAAGACTCCTGTTAGTTACCTCC
2.4.5. Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR
2.4.5.1. Nguyên lý
Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn. Nguyên lý của kỹ thuật là dùng enzym polymerase để tổng hợp nên các DNA mới từ DNA khuôn ban đầu. Thành phần chính của phản ứng gồm có DNA khuôn, mồi, dung dịch đệm, 4 loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP), DNA polymerase. Gồm 3 giai đoạn chính:
- Giai đoạn biến tính: dùng nhiệt độ cao (980C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép [12].
- Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ được hạ xuống tạo điều kiện cho tự bắt cặp của mồi vào sợi DNA khuôn. Nhiệt độ này phụ thuộc vào bản chất của mồi như trình tự và số lượng nucleotide của mồi [12].
- Giai đoạn kéo dài: tại 720C DNA polymerase s hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại dNTP [12].
Để có quy trình khuếch đại đoạn gen chứa các SNP trong nghiên cứu đặc hiệu và ổn định thì nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ của DNA và nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR cần phải được xác định, tối ưu chuẩn xác.
2.4.5.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR
Chất lượng sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose với quy trình tiến hành như sau:
- Nồng độ gel agarose sử dụng: 1,5% (1,5 g agarose pha trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1 X).
- Điện di gel agarose trong đệm TAE 1 X, hiệu điện thế 100 V, trong vòng 45 phút. Sử dụng hệ thống máy điện di MultiSub Choice, Cleaver Scientific, Bỉ.
- Dùng thang chuẩn: Marker 100 - 4 kb Plus (Lonza).
- Thể tích mẫu điện di: 5 µl sản phẩm sau PCR + 1 µl dye 6 X; 5 µl Marker 100 - 4 kb Plus (Lonza) (thường tra ở giếng đầu tiên để kiểm tra độ chính xác kích thước các băng điện di).
- Kết quả: hình ảnh điện di được ghi lại bằng hệ thống chụp ảnh điện di Gel- DocItx.
Mẫu PCR có chất lượng tốt là những mẫu có băng điện di sáng, rõ nét, không