3.2.2. Tối ưu quy trình PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1
3.2.2.1. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Chúng tôi tiến hành PCR với 10 nhiệt độ dao động quanh nhiệt độ gắn mồi được hãng khuyến cáo. Đối chứng dương chúng tôi sử dụng 1 mẫu DNA trong đề tài. Kết quả như sau:
SNP CYP2C9*3
Hình 3.2. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3
Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn (-): đối chứng âm, làn (+): đối chứng dương.
Từ khoảng nhiệt độ 50,8 - 56,600C xuất hiện các băng điện di không đặc hiệu. Ở khoảng nhiệt độ từ 67,7 - 69,00C băng điện di giảm độ sáng hoặc không lên băng. Trong khoảng nhiệt độ 58,8-65,50C băng điện di lên đặc hiệu, không bị smear, đặc biệt là ở 63,30C băng điện di lên sáng r , đặc hiệu.
Do đó chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 là: 63,30C.
SNP rs9923231 trên gen VKORC1
Hình 3.3. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1
Ở khoảng nhiệt độ từ 50,8 - 63,30
C băng điện di lên sáng rõ, tuy nhiên xuất hiện nhiều băng phụ, không đặc hiệu kèm theo. Còn tại nhiệt độ 67,20C băng điện di giảm độ sáng. Trong khoảng nhiệt độ từ 60,9 - 65,50C và tại nhiệt độ 69,00C băng điện di lên sáng rõ, không bị smear, các băng điện di đặc hiệu, không xuất hiện các băng phụ. Đặc biệt là ở nhiệt độ 65,50C băng điện di lên sáng rõ, không có băng phụ và không bị smear.
Do đó chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 là:65,50C.
SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Hình 3.4. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn (-): đối chứng âm, làn (+): đối chứng dương
Ở trong khoảng nhiệt độ từ 50,8 - 63,40C không xuất hiện các băng điện di, chỉ có các băng phụ hoặc smear. Tại nhiệt độ từ 65,9 - 70,40C băng điện di giảm độ sáng. Với nhiệt độ 73,50C không lên băng điện di. Tuy nhiên tại nhiệt độ 72,20C băng điện di lên sáng, đặc hiệu, không bị smear hay đứt gãy.
Do đó chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 là: 72,20C.
3.2.2.2. Tối ưu nồng độ mồi, nồng độ DNA cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Chúng tôi lần lượt thực hiện phản ứng PCR ở các nồng độ mồi lần lượt là: 0,5; 0,7 và 0,9 µM.
Tiếp theo, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nồng độ DNA được chọn lần lượt là: 5, 10, 50, 100 và 200 ng/µl.
Kết quả của phản ứng tối ưu nồng độ mồi và tối ưu nồng độ DNA cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% (quy trình điện di giống quy trình điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR ở mục 2.4.5.2).
SNP CYP2C9*3
Hình 3.5. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng
khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3
Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn ĐC-: đối chứng âm.
Kết quả phản ứng PCR tối ưu nồng độ mồi (Hình 3.4-A) ở cả 3 nồng độ mồi: 0,5; 0,7 và 0,9 µM các băng điện di đều lên sáng rõ, không bị smear, không xuất hiện các băng phụ, băng điện di lên đặc hiệu.
Với phản ứng PCR tối ưu nồng độ DNA (Hình 3.4-B) ở tất cả nồng độ DNA được chọn: 5; 10; 50; 100 và 200 ng/µl các băng điện di đều lên sáng, không bị smear, đứt gãy, không xuất hiện các băng phụ và băng điện di lên đặc hiệu. Tuy nhiên băng điện di ở vị trí nồng độ DNA 100 ng/µl lên sáng rõ nhất.
Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 là: 0,5 µM.
Nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP
SNP rs9923231 trên gen VKORC1
Hình 3.6. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1
Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn ĐC-: đối chứng âm.
Kết quả của phản ứng PCR tối ưu nồng độ mồi (Hình 3.5-A): ở nồng độ mồi 0,7 và 0,9 µM băng điện di lên sáng tuy nhiên lại bị nhiều băng phụ. Còn ở nồng độ mồi 0,5 µM băng điện di lên sáng r , đặc hiệu và không xuất hiện các băng phụ.
Tiếp theo chúng tôi thực hiện phản ứng PCR tối ưu nồng độ DNA (Hình 3.5- B) ở các nồng độ DNA: 5; 10 và 50 ng/µl các băng điện di lên mờ hoặc lên sáng nhưng kèm nhiều băng phụ. Còn ở nồng độ DNA: 100 và 200 ng/µl các băng điện di đều lên sáng rõ, không xuất hiện các băng phụ, không bị smear và băng điện di lên đặc hiệu,
Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên VKORC1 là: 0,5 µM.
Nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên
SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Hình 3.7. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn ĐC-: đối chứng âm.
Kết quả của phản ứng PCR tối ưu nồng độ mồi (Hình 3.6-A): với nồng độ mồi 0,9 µM băng điện di không xuất hiện. Tại nồng độ mồi: 0,5 và 0,7 µM băng điện di lên sáng, đặc hiệu, không xuất hiện băng phụ, không bị smear.
Chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng PCR tối ưu nồng độ DNA (Hình 3.6-B), kết quả như sau: ở nồng độ DNA: 5; 10 và 50 ng/µl không xuất hiện băng điện di. Ở nồng độ DNA: 100 và 200 ng/µl các băng điện di đều lên sáng rõ, đặc hiệu, không xuất hiện các băng phụ.
Vì vậy, chúng tôi chọn nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 là: 0,5 µM và nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 là: 100 ng/µl.
Như vậy, chúng tôi chọn được nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP cho cả 3 SNP trong nghiên cứu là: 0,5 µM. Nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP cho cả 3 SNP trong nghiên cứu là: 100 ng/µl.
3.2.3. Kết quả phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Sau khi tiến hành tối ưu các điều kiện: nhiệt độ gắn mồi tối ưu, nồng độ mồi tối ưu, nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP
CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1. Cùng với những hoá chất cần thiết khác như: dNTP mix (2 mM), 5X HF buffer, phusion pol (2u/µl) sử dụng theo nồng độ như khuyến cáo sử dụng của hãng. Ngoài ra còn có nước khử ion (DDW) cũng là thành phần quan trọng tham gia quy trình khuếch đại đoạn gen chứa các SNP trong nghiên cứu.
Chúng tôi đã xây dựng được quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP
CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 với các thành phần và điều kiện phản ứng như trình bày dưới đây.
Bảng 3.3. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3
Thành phần Nồng độ hoạt động Thể tích 1 phản ứng (30 µl) Điều kiện phản ứng (Chu trình nhiệt) DNA 100 ng/µl 1,5 µl - Biến tính: 980C-3 phút. - 35 chu kỳ: + 980C-10 giây; + 63,30C-30 giây; + 720C-30 giây - Kết thúc: 720C-2 phút. dNTP mix 2 mM 0,2 mM 3,0 µl 5X HF buffer 1 X 6,0 µl Mồi F [10] mM 0,5 µM 1,5 µl Mồi R [10] mM 0,5 µM 1,5 µl Phusion pol 2u/µl 0,02 u/µl 0,3 µl
Bảng 3.4. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 Thành phần Nồng độ hoạt động Thể tích 1 phản ứng (30 µl) Điều kiện phản ứng (Chu trình nhiệt) DNA 100 ng/µl 1,5 µl - Biến tính: 980C-3 phút. - 35 chu kỳ: + 980C-10 giây; + 65,50C-30 giây; + 720C-30 giây - Kết thúc: 720C-2 phút. dNTP mix 2 mM 0,2 mM 3,0 µl 5X HF buffer 1 X 6,0 µl Mồi F [10] mM 0,5 µM 1,5 µl Mồi R [10] mM 0,5 µM 1,5 µl Phusion pol, 2 u/µl 0,02 u/µl 0,3 µl
DDW 16,2 µl
Bảng 3.5. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 Thành phần Nồng độ hoạt động Thể tích 1 phản ứng (30 µl) Điều kiện phản ứng (Chu trình nhiệt) DNA 100 ng/µl 1,5 µl - Biến tính: 980C-3 phút. - 35 chu kỳ: + 980C-10 giây; + 72,20C-30 giây; + 720C-30 giây - Kết thúc: 720C-2 phút. dNTP mix, 2 mM 0,2 mM 3,0 µl 5X HF buffer 1 X 6,0 µl Mồi F [10] mM 0,5 µM 1,5 µl Mồi R [10] mM 0,5 µM 1,5 µl Phusion pol 2, u/µl 0,02 u/µl 0,3 µl
Áp dụng quy trình PCR khuếch đại đoạn gen chứa các SNP trong nghiên cứu cho 100 mẫu bệnh nhân trong nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy đã khuếch đại thành công đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9934438, rs9923231 trên gen VKORC1.
Điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% (quy trình điện di tương tự quy trình điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR mục 2.4.5.2).
Hình 3.8. Điện di sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C9*3, SNP rs9923231, SNP rs9934438
Làn (M): Marker 100-4 kb Plus.
Làn 1, 2, 3: sản phẩm phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 của bệnh nhân: Đt 01.
Làn 4,5,6: Đối chứng âm.
Trên gel điện di, các mẫu DNA tạo thành một băng duy nhất, rõ nét, không có băng phụ, không bị smear. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP
CYP2C9*3 điện di cho băng có kích thước: 719 bp. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 điện di cho băng có kích thước: 771 bp. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1
điện di cho băng có kích thước: 714 bp.
Kết quả cho thấy các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa các SNP trong nghiên cứu là đặc hiệu, các yếu tố cần thiết khác của phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa các SNP trong nghiên cứu đã được tối ưu tốt. Các sản phẩm PCR của các SNP trong nghiên cứu đủ điều kiện để sử dụng cho quy trình giải trình tự và RFLP tiếp theo.