gen VKORC1
Ngày nay, kinh tế và đời sống của con người ngày càng phát triển và nâng cao đi đôi với nó là lĩnh vực sức khỏe cũng được quan tâm nhiều hơn. Những kĩ thuật giúp phát hiện sớm bệnh và sử dụng những phương pháp điều trị tiên tiến nhằm giảm chi phí và điều trị trúng đích ngày càng được chú trọng hơn. Y sinh học phân tử ra đời nhằm hỗ trợ việc xác định chính xác căn nguyên bệnh và từ đó đưa ra liệu pháp điều trị đích phù hợp. Với kỹ thuật này, ngày nay chúng ta có thể phân tích một đoạn gen bất kì nào đó để phát hiện những bất thường, các dấu hiệu, nguy cơ bệnh tật từ đó có thể đưa ra chẩn đoán sớm và có cách điều trị phù hợp.
Để xác định các kiểu gen của từng alen, bệnh nhân cần trải qua quá trình tiến hành xét nghiệm bằng cách lấy mẫu máu bệnh nhân, bảo quản trong ống có chứa chất chống đông EDTA. Mẫu được bảo quản theo tiêu chuẩn và chuyển đến phòng xét nghiệm để tiến hành quy trình xác định kiểu gen. Đầu tiên, mẫu sinh phẩm của bệnh nhân s được tách DNA tổng số, đây là khâu đầu tiên và rất quan trọng vì chất lượng sản phẩm DNA có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả của các kĩ thuật y sinh học phân tử tiếp theo. Sản phẩm DNA sau khi được tách chiết phải có nồng độ đảm bảo, độ tinh sạch cao, không bị đứt gãy, không nhiễm tạp. Để kiểm tra chất lượng sản phẩm DNA tổng số, chúng tôi sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang để đánh giá định lượng. Bước tiếp theo của nghiên cứu là khuếch đại đoạn gen chứa SNP
CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1.
Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định kiểu gen của đa hình di truyền đã được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả như: kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP), giải trình tự gen, kỹ thuật sử dụng đầu dò DNA (DNA-probe). Tuy nhiên, trong số đó, PCR-RFLP và giải trình tự gen là hai phương pháp được sử dụng phổ biến nhất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Quy trình PCR đã được tối ưu tốt và sản phẩm thu là: đoạn gen dài 719 bp chứa SNP CYP2C9*3, đoạn gen dài 771 bp chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 và đoạn gen dài 714 bp chứa SNP
rs9934438 trên gen VKORC1. Sử dụng sản phẩm PCR thu được, chúng tôi tiếp tục tinh sạch và xác định nồng độ DNA trước khi thực hiện gửi giải trình tự và RFLP.
Trong các mẫu nghiên cứu của chúng tôi khi tiến hành xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp giải trình tự gen đều cho kết quả ba loại kiểu gen: đồng hợp tử đột biến: GG, dị hợp tử: AG và đồng hợp tử kiểu dại: AA. Trong khi đó, khi xác định kiểu gen của SNP
CYP2C9*3 bằng phương pháp giải trình tự gen thì chỉ cho kết quả hai kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại: AA và dị hợp tử: AC (không thấy xuất hiện bệnh nhân nào mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến: CC).
Mặc dù phương pháp giải trình tự gen vẫn là tiêu chuẩn vàng để xác định các đột biến điểm. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự gen đòi hỏi chi phí cao, thời gian thực hiện lâu. Vì vậy, ngoài phương pháp giải trình tự gen, chúng tôi xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp RFLP vì cả hai SNP này đều có vị trí cắt đặc hiệu với enzyme cắt tương ứng là Msp1 và HinfI. Còn SNP CYP2C9*3 không có vị trí cắt đặc hiệu nên chúng tôi chỉ sử dụng phương pháp giải trình tự gen để xác định kiểu gen của SNP này.
Sử dụng phương pháp RFLP với SNP rs9923231 trên gen VKORC1 cho kết quả kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại (AA), kiểu gen đồng hợp tử đột biến (GG), kiểu gen dị hợp tử (AG).
Sử dụng phương pháp RFLP với SNP rs9934438 trên gen VKORC1 cho kết quả kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử đột biến (GG), kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại (AA) và kiểu gen dị hợp tử (AG).
Thực hiện so sánh và đối chiếu kết quả xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự gen và kỹ thuật RFLP trên 20 bệnh nhân đầu với SNP rs9923231 và rs9934438 trên gen VKORC1 chúng tôi nhận thấy cả hai kĩ thuật xác định kiểu gen này đều cho kết quả như nhau. Trong đó, kỹ thuật RFLP thao tác đơn giản, chi phí rẻ và thời gian xác định được kiểu gen nhanh hơn. Do đó, tất cả các mẫu bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu còn lại chúng tôi đều sử dụng phương pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và rs9934438 trên gen VKORC1.
Kết quả phân tích gen của chúng tôi có sự tương đồng với các nghiên cứu trước đó. Với gen CYP2C9 nghiên cứu của nhiều tác giả sử dụng phương pháp giải trình tự sử dụng cặp mồi nhân dòng khác nhau [24][33]. Với gen VKORC1, ngoài phương pháp giải trình tự gen trực tiếp thì đa số các nghiên cứu của các nhóm tác giả khác đều sử dụng phương pháp RFLP [31]. Nghiên cứu của tác giả Harrington và cs (2008) từ Vương Quốc Anh cũng sử dụng enzym cắt Hinf để xác định trình tự của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 [37]. Và nghiên cứu của tác giả Chua Y.A et al (2015) tại Malaysia cũng sử dụng enzym Msp1 để cắt SNP rs9923231 trên gen
VKORC1 [112]. Kết quả nghiên cứu của những nhóm tác giả này cũng tương đồng so với kết quả nghiên cứu này của chúng tôi.