- Mẫu máu bệnh nhân được bảo quản trong chất chống đông EDTA ở -300C. - Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm.
2.4. Các bƣớc nghiên cứu
2.4.1. Quy trình nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được chúng tôi thực hiện như sơ đồ thể hiện dưới đây
Bệnh nhân thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn
Mẫu máu của bệnh nhân/EDTA
Tách DNA tổng số
Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3, SNP rs9923231 trên gen VKORC1 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương
pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu
Tinh sạch sản phẩm PCR
Xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3
bằng phương pháp giải trình tự gen
Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 trên
gen VKORC1 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1 bằng phương pháp RFLP có đối
chiếu kết quả với phương pháp giải trình tự gen ở 20 mẫu bệnh nhân đầu
Xác định tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP
CYP2C9*3, SNP rs9923231 trên gen VKORC1 và
2.4.2. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu
- Cách lấy mẫu: 2 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chứa vào ống chuyên dụng chứa sẵn chất chống đông EDTA. Đảm bảo mẫu không bị nhiễm bẩn và không bị lẫn các mẫu với nhau, ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và mã code. Mỗi ống máu phải đủ cho nhiều hơn 1 lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu và có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định được kiểu gen của bệnh nhân.
- Cách bảo quản: tại địa điểm thu nhận, mẫu được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ từ -200C đến -300C không quá 1 ngày, sau đó được vận chuyển đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Mẫu được bảo quản ở -300C cho đến khi dùng.
- Kí hiệu mẫu: ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin: mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu, đánh dấu số thứ tự mẫu nghiên cứu. Thông tin về mẫu máu của bệnh nhân phải được lưu trong sổ với các thông tin: tên, tuổi, số giường và phòng điều trị, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.
2.4.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số
2.4.3.1. Tách chiết DNA tổng số
- Nguyên lý: sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số. Nguyên lý của kit này dựa trên sự hấp thụ chọn lọc của các acid nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải phóng DNA; DNA liên kết với màng silica-gel; Loại bỏ tạp chất trên màng silica- gel với Wash Buffer; Thu nhận DNA. Trước khi tách, lấy mẫu giã đông từ từ trên đá hoặc trong tủ mát. Khi mẫu đã giã đông hoàn toàn mới được sử dụng để tiến hành tách DNA tổng số.
-Quy trình tách DNA tổng số bằng kit E.Z.N.A blood DNA Mini Kit: 1. Lắc đều ống máu. Chuyển 250 µl mẫu vào ống epp 1,5 ml vô trùng. 2. Thêm 25 µl OB Protease Solution và 250 µl BL Buffer. Vortex 10 giây 3. Ủ 650C trong 10 phút. Chú ý: sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15s 4. Thêm 260 µl Ethanol 100%. Vortex trong 20 giây
5. Ly tâm 1000 v/p trong 15s để đảm bảo mẫu không dính trên thành ống Chú ý: Tất cả các bước ly tâm phải cân và đối trọng các mẫu ly tâm
6. Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 ml 7. Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µl)
8. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút 9. Bỏ dịch lọc và Collection Tube
10. Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 ml mới 11. Thêm 500 µl HBC Buffer
12. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút 13. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube 14. Thêm 700 µl DNA Wash Buffer
15. Ly tâm trong 14.000 vòng/phút trong 1 phút 16. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube
17. Lặp lại các bước 14-16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer 18. Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 v/p trong 2 phút 19. Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2ml mới
20. Thêm 100 µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 650C). Ủ 650C, 5 phút. 21. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút
22. Thêm 50 µl Elution Buffer, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng 23. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút
24. Thu và bảo quản DNA ở -300C.
2.4.3.2. Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang
Các mẫu sau khi tách DNA tổng số đều được kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang ở bước sóng A260 nm và A280 nm để đánh giá nồng độ DNA và độ tinh sạch của DNA. Phương pháp này sử dụng máy đo quang phổ nồng độ nano, Nano Photometer-implen NP80. Quy trình thao tác chung gồm các bước sau:
- Đo Blank: đo với 2 µl môi trường dùng để bảo quản mẫu DNA tổng số. - Đo mẫu DNA: đo với 2 µl mẫu DNA tổng số vừa thu được.
Mỗi mẫu phải đo ít nhất 2 lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu.
2.4.4. Trình tự mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Trình tự các cặp mồi được tham chiếu trên ngân hàng gen NCBI và đặt tổng hợp từ hãng IDT-Mỹ. Trình tự mồi xuôi và ngược như sau:
Bảng 2.1. Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen chứa các alen
Alen Mồi Trình tự Kích thƣớc (bp) CYP2C9*3 rs1057910-F GCATCTGTAACCATCCTCTC 719 rs1057910-R GTGTCAAGATTCAGTTCTTTCC rs9923231 rs9923231-F TACAACTCCCATCATGCCTG 771 rs9923231-R GACCATCGTCAATCTCTACC rs9934438 rs9934438-F GGTGCCTTAATCCCAGCTACTC 714 rs9934438-R AAAGACTCCTGTTAGTTACCTCC
2.4.5. Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR
2.4.5.1. Nguyên lý
Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn. Nguyên lý của kỹ thuật là dùng enzym polymerase để tổng hợp nên các DNA mới từ DNA khuôn ban đầu. Thành phần chính của phản ứng gồm có DNA khuôn, mồi, dung dịch đệm, 4 loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP), DNA polymerase. Gồm 3 giai đoạn chính:
- Giai đoạn biến tính: dùng nhiệt độ cao (980C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép [12].
- Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ được hạ xuống tạo điều kiện cho tự bắt cặp của mồi vào sợi DNA khuôn. Nhiệt độ này phụ thuộc vào bản chất của mồi như trình tự và số lượng nucleotide của mồi [12].
- Giai đoạn kéo dài: tại 720C DNA polymerase s hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại dNTP [12].
Để có quy trình khuếch đại đoạn gen chứa các SNP trong nghiên cứu đặc hiệu và ổn định thì nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ của DNA và nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR cần phải được xác định, tối ưu chuẩn xác.
2.4.5.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR
Chất lượng sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose với quy trình tiến hành như sau:
- Nồng độ gel agarose sử dụng: 1,5% (1,5 g agarose pha trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1 X).
- Điện di gel agarose trong đệm TAE 1 X, hiệu điện thế 100 V, trong vòng 45 phút. Sử dụng hệ thống máy điện di MultiSub Choice, Cleaver Scientific, Bỉ.
- Dùng thang chuẩn: Marker 100 - 4 kb Plus (Lonza).
- Thể tích mẫu điện di: 5 µl sản phẩm sau PCR + 1 µl dye 6 X; 5 µl Marker 100 - 4 kb Plus (Lonza) (thường tra ở giếng đầu tiên để kiểm tra độ chính xác kích thước các băng điện di).
- Kết quả: hình ảnh điện di được ghi lại bằng hệ thống chụp ảnh điện di Gel- DocItx.
Mẫu PCR có chất lượng tốt là những mẫu có băng điện di sáng, rõ nét, không bị smear, đứt đoạn, không xuất hiện băng phụ và đúng với kích thước theo lý thuyết của SNP sau khi so sánh với thang chuẩn (Marker).
2.4.6. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR của các SNP sau khi kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose nếu đủ điều kiện về chất lượng (băng sáng r , đúng với kích thước lý thuyết, không bị đứt gãy, smear) s được tinh sạch bằng phương pháp sử dụng kit tinh sạch GeneJET PCR trước khi thực hiện cắt bằng enzym giới hạn hoặc gửi giải trình tự.
Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR được thực hiện như sau:
1. Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR với tỉ lệ 1:1, mix đều. 2. Nếu DNA < 500 bp, thêm isopropanol 100% tỉ lệ 1:2, mix đều.
4. Ly tâm trong 30-60 giây, bỏ phần dịch lọc.
5. Thêm 700 µl Wash Buffer vào cột, ly tâm 14.000 v/p ở 60 s, bỏ dịch lọc. 6. Lặp lại bước 4, 5.
7. Ly tâm cột ở 14.000 v/p trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn Wash Buffer. 8. Chuyển cột lọc sang ống epp 1,5 ml đã khử trùng.
9. Thêm 50 µl Elution Buffer. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. 10. Ly tâm ống epp ở 14.000 v/p trong vòng 1 phút, thu dịch lọc. 11. Bảo quản ở -300C nếu chưa sử dụng ngay.
2.4.7. Xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 sử dụng phương pháp giải trình tự gen gen
Sản phẩm sau khi PCR s được tinh sạch và kiểm tra nồng độ bằng cách đo OD (định lượng DNA) sử dụng máy quang phổ thể tích nano, Nano Photometer- implen NP80 (quy trình giống với quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang ở mục 2.4.3.2). Tuỳ vào nồng độ của từng mẫu sau khi tinh sạch mà chúng tôi cô đặc hoặc pha loãng mẫu cho tới khi nồng độ DNA của mẫu lúc này đạt tới nồng độ 40 - 50 ng/µl để tiếp tục đem gửi giải trình tự mẫu.
Do vị trí điểm đột biến của SNP CYP2C9*3 không có trình tự nhận biết cho enzym cắt giới hạn. Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp giải trình tự gen để xác định kiểu gen SNP CYP2C9*3. Dùng 25 µl sản phẩm PCR lên băng điện di đặc hiệu và sáng nét tinh sạch và gửi đi giải trình tự tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự gen được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9. Kết quả kiểu gen của SNP được xác định dựa trên hình ảnh giải trình tự thu được.
Kết quả giải trình tự gen tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau:
- Bốn loại nucleotide được phân biệt bởi các màu khác nhau (ví dụ: màu đen là Guanine (G), màu xanh nước biển là Cytosine (C), màu xanh lá cây là Adenine (A) và màu đỏ là Thymine (T).
- Tín hiệu huỳnh quang của các nucleotide là các đỉnh màu đơn, r ràng. - Không có tín hiệu nhiễu (hoặc có tín hiệu nhiễu nhưng nền nhiễu thấp).
2.4.8. Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 sử dụng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải trình VKORC1 sử dụng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải trình tự gen
Sản phẩm sau khi PCR s được tinh sạch và kiểm tra nồng độ bằng cách đo OD (định lượng DNA) sử dụng máy quang phổ thể tích nano, Nano Photometer- implen NP80 (quy trình giống với quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang ở mục 2.4.3.2). Tuỳ vào nồng độ của từng mẫu sau khi tinh sạch mà chúng tôi cô đặc hoặc pha loãng mẫu cho tới khi nồng độ DNA của mẫu lúc này đạt tới nồng độ 40 - 50 ng/µl để tiếp tục thực hiện phản ứng RFLP hoặc gửi giải trình tự mẫu.
2.4.8.1. Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp RFLP
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, DNA s được cô đặc hoặc pha loãng cho đến nồng độ 40 - 50 ng/µl và tiến hành quy trình cắt bằng enzym cắt giới hạn.
Để đảm bảo phản ứng cắt xảy ra hoàn toàn cũng như kiểm tra độ lặp lại của phản ứng, mỗi mẫu s được cắt (quá trình ủ) ở 2 điểm thời gian trong vùng thời gian cắt đã được chúng tôi tối ưu.
Bảng 2.2. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9923231 trên gen VKOR1
Thành phần Thể tích 1 phản ứng (7,5 µl) Điều kiện phản ứng DNA 3,0 µl Ủ ở nhiệt độ: 370C trong 2 điều kiện: 30 và 45 phút 10 X Buffer 0,75 µl Enzym Msp1 0,15 µl DDW 3,6 µl \
Bảng 2.3. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9934438 trên gen VKORC1 Thành phần Thể tích 1 phản ứng (7,5 µl) Điều kiện phản ứng DNA 3,0 µl - Ủ ở nhiệt độ: 370 C trong 2 điều kiện: 15 và 30 phút. - Bất hoạt ở nhiệt độ: 800C trong 5 phút. 10 X Buffer 0,75 µl Enzym HinfI 0,15 µl DDW 3,6 µl
Kiểm tra kết quả RFLP của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1 bằng phương pháp điện di trên agarose 1,5% trong thời gian 45 phút, hiệu điện thế 100 V (quy trình và các bước điện di kiểm tra kết quả giống với quy trình điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR ở mục 2.4.5.2). Ảnh điện di được ghi lại bằng hệ thống chụp ảnh điện di Gel-DocItx. So sánh kết quả điện di với Marker 100 - 4 kb Plus.
2.4.8.2. Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp giải trình tự gen ở 20 mẫu nghiên cứu đầu tiên.
Sau khi có kết quả phân tích kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp RFLP. Để kiểm tra độ chính xác của phương pháp này, chúng tôi cũng tiến hành phương pháp giải trình tự gen ở 20 mẫu bệnh nhân đầu tiên. Nếu kết quả của cả hai phương pháp như nhau, điều đó cho thấy quy trình và điều kiện phản ứng của phương pháp RFLP được tối ưu tốt và cho kết quả chính xác. Do đó, các mẫu bệnh nhân tiếp theo chúng tôi s sử dụng phương pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1. Vì phương pháp này cho kết quả nhanh và hiệu quả kinh tế cho bệnh nhân đồng thời cũng tiết kiệm thời gian nghiên cứu.
Dùng 25 µl sản phẩm PCR lên băng điện di đặc hiệu, sáng rõ sau khi tinh sạch được gửi đi giải trình tự gen tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9. Kết quả kiểu gen của các đa hình được xác định dựa trên các ảnh giải trình tự thu được.
2.4.9. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Để xác định được kiểu gen của từng bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng tôi. Như đã trình bày ở trên, chúng tôi cần tìm được kiểu gen của từng alen hay nói cách khác xác định được từng SNP. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn 3 SNP: SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1. Sau khi đã có kết quả kiểu gen chúng tôi s đánh giá tần số phân bố alen, phân bố kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1.
2.5. Xử lý và phân tích số liệu
- Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0, exel 2010.
- Sử dụng các test thống kê: tính trị số trung bình, trung vị, T- test, 2, ANOVA test, Chisquare-test, Fisher test…một cách phù hợp nhất.
2.6. Các loại sai số và cách khắc phục
2.6.1. Sai số có thể mắc phải
- Sai số trong quá trình lựa chọn bệnh nhân.
- Sai số trong quá trình tiến hành xét nghiệm và thí nghiệm: sai số hệ thống do máy móc hoặc do các loại test, kit. Sai số ngẫu nhiên do người làm xét nghiệm hoặc thí nghiệm, do ảnh hưởng của môi trường tác động lên kết quả xét nghiệm.
- Sai số trong quá trình thu thập số liệu:
+ Trong quá trình thăm khám bệnh nhân.
+ Trong quá trình ghi chép bệnh án: không ghi ch p được các đặc điểm lâm