:
3.2.1.Sàng lọc kháng thể từ thƣ viện Griffin.1
Thƣ viện phage của Griffin.1 đƣợc sử dụng để sàng lọc. Thƣ viện phage Griffin.1 có chứa các đoạn kháng thể tổng hợp đƣợc tạo nên từ các vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL). Chúng đƣợc kết hợp một cách ngẫu nhiên và liên kết với nhau thông qua peptide liên kết để tạo thành đoạn chuỗi đơn (scFv). Các đoạn scFv đƣợc dung hợp với protein vỏ pIII của thực khuẩn thể M13 để tạo thành thƣ viện các đoạn kháng thể bộc lộ trên phage [66].
Để thu đƣợc kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích (ở đây là tế bào
E. coli O157:H7) từ thƣ viện này, cần thực hiện các vòng sàng lọc. Một cách lý tƣởng thì chỉ cần qua một vòng sàng lọc là có thể thu đƣợc dòng phage mang đoạn kháng thể mong muốn. Tuy nhiên do tế bào chủ (E. coli TG1) và các thế hệ con cháu của nó chỉ tạo ra đƣợc 104-105 hạt phage, bên cạnh đó các dòng phage lại gắn không đặc hiệu đã làm giới hạn khả năng làm giàu dòng phage mong muốn sau mỗi chu kỳ. Do vậy, trong thực nghiệm cần phải sàng lọc nhiều hơn một vòng để làm giàu dòng phage gắn đặc hiệu so với các dòng gắn không đặc hiệu. Thông thƣờng, chỉ cần tiến hành 2 đến 4 vòng sàng lọc là đủ để tăng số lƣợng phage gắn đặc hiệu và giảm các phage gắn không đặc hiệu [58]. Trong trƣờng hợp sàng lọc tế bào thì độ đa dạng của kháng thể thu đƣợc là rất lớn vì các yếu tố mà kháng thể phage có thể gắn vào là toàn bộ các kháng nguyên trên bề mặt tế bào E. coli O157:H7. Vì vậy, việc tiến hành thêm các vòng sàng lọc là cần thiết.
Trong luận án 5 vòng sàng lọc đã đƣợc thực hiện. Vòng 1, 2, 3, 5 sử dụng tế bào E. coli O157:H7 làm kháng nguyên và vòng 4 sử dụng tế bào E. coli ATCC 25922 làm kháng nguyên, là vòng sàng lọc loại trừ. Do tế bào E. coli O157:H7 có mang những kháng nguyên bề mặt giống tế bào E. coli bình thƣờng vì vậy vòng sàng lọc loại trừ sẽ giúp loại bớt những dòng phage biểu hiện các kháng thể không đặc hiệu. Sau đó vòng sàng lọc thứ 5 đƣợc tiến hành để nhân các dòng phage gắn đặc hiệu với tế bào E. coli O157:H7.
Thí nghiệm sàng lọc loại trừ chỉ khác thí nghiệm sàng lọc với tế bào đích ở tế bào cố định và bƣớc thu phage. Đối với các vòng sàng lọc thƣờng, phage đƣợc gắn với tế bào E. coli O157:H7, rồi tiến hành ly tâm và rửa để loại bỏ phage không gắn
với tế bào E. coli O157:H7, sau đó sử dụng triethylamine để tách phage ra khỏi tế bào E. coli O157:H7 và thu nhận dung dịch phage. Với thí nghiệm sàng lọc loại trừ, cho phage gắn với tế bào E. coli ATCC 25922 bình thƣờng, ủ rồi ly tâm để thu dịch chứa phage không gắn với tế bào E. coli ATCC 25922 này.
Sau mỗi vòng sàng lọc, dung dịch phage sau giải hấp phụ đƣợc làm giàu bằng cách cho xâm nhiễm vào vi khuẩn E. coli TG1, cho nhân lên và bổ sung helper phage và thu hạt phage. Khả năng gắn kết của hỗn hợp phage với tế bào đích sau mỗi vòng sàng lọc đƣợc đánh giá bằng kỹ thuật ELISA (Hình 3.15).
Hình 3.15. Khả năng gắn kết của hỗn hợp phage thu đƣợc sau mỗi vòng sàng lọc với dòng tế bào E. coli O157:H7
Kết quả đo của phản ứng ELISA đƣợc thể hiện trên hình 3.15 cho thấy từ vòng sàng lọc 1 đến 3 với vi khuẩn E. coli O157:H7, tín hiệu ELISA của hỗn hợp phage thu đƣợc tăng dần do nồng độ phage biểu hiện kháng thể gắn đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc tăng lên và phage gắn không đặc hiệu giảm đi. Vòng thứ 4 tiếp theo chủng vi khuẩn E. coli không độc (chủng E. coli ATCC 25922) đƣợc sàng lọc nhằm loại trừ các đoạn kháng thể bộc lộ trên phage gắn với kháng nguyên bề mặt tế bào không đặc trƣng cho đối với vi khuẩn E. coli O157:H7. Vòng thứ 5 dùng vi khuẩn E. coli O157:H7 làm đối tƣợng sàng lọc cho kết quả tăng khả năng gắn kết mạnh. Điều này chứng tỏ sau 5 vòng sàng lọc, hỗn hợp phage thu đƣợc có
chứa chủ yếu các dòng phage mà kháng thể bộc lộ trên đó gắn đặc hiệu với vi khuẩn
E. coli O157:H7.
Để tạo dòng, hỗn hợp phage sau vòng sàng lọc 5 đƣợc xâm nhiễm vào E. coli
chủng TG1, sau đó 37 khuẩn lạc chứa phagemid đã chọn đƣợc nhân lên và thu phage. Phage thu đƣợc từ các khuẩn lạc riêng rẽ này dƣới dạng từng dòng riêng biệt và đƣợc sử dụng cho thí nghiệm xác định khả năng gắn kết với E. coli O157:H7 bằng phƣơng pháp ELISA.