:
3.4.3.Kiểm tra hoạt tính của kháng thể tái tổ hợp bằng ELISA
Để đánh giá độ nhạy của kháng thể tái tổ hợp tạo ra với vi khuẩn E. coli
O157:H7, phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên là vi khuẩn E. coli O157:H7, mẫu đối chứng là vi khuẩn ATCC và PBS đã đƣợc thực hiện (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Kết quả của phản ứng ELISA xác định độ nhạy của kháng thể tái tổ hợp và kháng thể chuẩn Kháng thể Mẫu OD 405nm Kháng thể tái tổ hợp Kháng thể chuẩn (AB75244) PBS1X 0,05 ± 1.10 -6 0,048 ± 3.10-6 ATCC 0,067 ± 2,33.10 -6 0,061 ± 0.000013 O157 0,59 ± 0,00026 0,78 ± 0,00079
Dựa vào kết quả trong bảng 3.4 có thể thấy cả kháng thể tái tổ hợp và kháng thể chuẩn đều không bắt cặp với vi khuẩn ATCC nhƣng bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157:H7, trong đó giá trị OD 405 nm đo đƣợc của kháng thể chuẩn cao hơn so với kháng thể tái tổ hợp.Kết quả này chứng tỏ kháng thể chuẩn có độ đặc hiệu cao hơn kháng thể tái tổ hợp. Để khẳng định sự sai khác giữa hai giá trị trung bình của hai loại kháng thể với vi khuẩn E. coli O157:H7 có ý nghĩa hay không, hàm T- test với số mẫu n =3 đã đƣợc sử dụng để kiểm tra.
Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm Excel, giá trị trung bình khi đo OD ở bƣớc sóng 405 nm của kháng thể tái tổ hợp là 0,59± 0,00026 và của kháng thể chuẩn là 0,78± 0,00079. Với hàm T-test kiểm tra 2 chiều thu ở mức α= 0,01 (với độ tin cậy là 99%) t= 27,428 > t0,01=9,92. Nhƣ vậy, sự sai khác về giá trị trung bình giữa hai mẫu là có ý nghĩa. Hay nói một cách khác, độ đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp tạo ra có ái lực thấp hơn so với kháng thể chuẩn của Hãng Abcam.
3.4.4. hạt nano
Các hạt nano gắn kháng thể có khả năng ứng dụng trong y sinh đặc biệt đối với quá trình điều trị và chẩn đoán. Trong điều trị, các ứng dụng chính của phức hợp nano-kháng thể là phát triển theo hƣớng phân phối thuốc đến mục tiêu đích, cùng với việc sửa chữa các mô. Trong chẩn đoán, ứng dụng của hạt nano-kháng thể có thể đƣợc sử dụng trong tế bào và sử dụng trong thí nghiệm invitro bao gồm yếu tố tƣơng phản trong chụp cộng hƣởng từ (Magnetic Resonance Imaging- MRI), cảm biến, chuyển gen, xét nghiệm miễn dịch....
Hình 3.30. Hình ảnh phức hợp kháng thể- silica bắt với tế bào E. coli O157:H7.
Các điểm sáng màu xanh là vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc bắt bởi phức kháng thể- silica khi soi ở độ phóng đại 60X dƣới kính hiển vi.
, độ đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp đã đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp gắn silica và soi dƣới kính hiện vi. Hạt nano silica chứa chất màu huỳnh quang FITC (SiO2-FITC) có kích thƣớc 60-80nm, nồng độ hạt là 4.1012 hạt/ml. Khi gắn kháng thể scFv, theo tính toán sẽ có khoảng 20 kháng thể/hạt nano. Phức hợp silica-kháng thể đƣợc nhuộm với vi khuẩn E. coli O157:H7 với đối chứng đƣợc sử dụng là vi khuẩn ATCC và chụp ảnh dƣới kính hiển vi điện tử ở độ phóng đại 60X (Hình 3.30).
Kết quả trên hình 3.30 cho thấy khi soi phức kháng thể-silica liên kết với vi khuẩn E. coli O157:H7 đã có rất nhiều điểm phát quang trên trƣờng kính. Điều đó chứng tỏ đã có nhiều kháng thể đã bám vào vi khuẩn E. coli O157:H7. Thí nghiệm cũng đƣợc tiến hành song song với đối chứng là vi khuẩn ATCC, tuy nhiên do kháng thể không bám vào vi khuẩn này, dẫn tới vi khuẩn không phát quang và không quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi.
Thảo luận
Hiện nay, kháng thể kháng E. coli O157:H7 đã đƣợc thƣơng mại hóa. Những kháng thể này đƣợc sử dụng nhƣ những kháng thể chuẩn để so sánh ái lực và độ đặc hiệu với các kháng thể tái tổ hợp đƣợc tạo ra. Việc so sánh này sẽ rút ngắn thời gian giúp cho các nhà khoa học
.
Kháng thể tái tổ hợp phage scFv cũng nhƣ các scFv tự đo đặc hiệu với E. coli
O157:H7 đƣợc tạo ra có lợi thế là các phân tử có bản chất ngƣời hoàn toàn. Khi ứng dụng kháng thể này trong chẩn đoán và điều trị sẽ giảm thiểu hiện tƣợng HAMA và các tác dụng phụ không mong muốn của phần Fc. Hơn nữa, kháng thể scFv này có bản chất là các kháng thể đơn dòng, do đó nó có đầy đủ khả năng ứng dụng giống nhƣ các kháng thể đơn dòng khác dùng trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị bệnh. Đặc biệt hơn, kháng thể scFv đƣợc sản xuất nhanh chóng, dễ dàng vào có giá thành rẻ cho nên việc ứng dụng chúng cũng đơn giản hơn rất nhiều.
Kháng thể tái tổ hợp scFv đặc hiệu E. coli O157:H7 tạo ra có thể dễ dàng thực hiện các phản ứng chẩn đoán chính xác vi khuẩn E. coli O157:H7 trong các mẫu nghiên cứu và các mẫu thực phẩm bằng các kỹ thuật nhƣ Dot blot, Western blot, ELISA ... Với kháng thể scFv tái tổ hợp đƣợc tạo ra, chúng tôi hy vọng kháng thể này có thể đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu sâu hơn, hƣớng tới phát triển kỹ thuật chẩn đoán và điều trị các bệnh liên quan tới vi khuẩn E. coli O157:H7.
KẾT LUẬN
1. Đã tách dòng và xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 ở Việt Nam với kích thƣớc là 1,5 kb. Trình tự 16S rRNA đã đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số HQ658163.
2. Đã tách dòng và xác định trình tự hai đoạn gen Stx1 và Stx2từ vi khuẩn E. coli O157:H7. Đoạn gen Stx1 và Stx2 có kích thƣớc tƣơng ứng là 151 bp và 205bp. Trình tự nucleotide của hai đoạn gen có độ tƣơng đồng trên 99% so với trình tự gen Stx của các chủng E. coli O157:H7 khác.
3. Đã ứng dụng phản ứng LAMP trên gen Stx2 để xác định vi khuẩn E. coli
O157:H7 với cặp mồi loop FIP/BIP, nồng độ DNA là 93,5 pg/µl trong 25 phút. Sản phẩm có thể đƣợc phát hiện bằng điện di hoặc nhuộm bằng chất nhuộm màu phát quang.
4. T phage mang đoạn gen mã hóa kháng thể scFv có khả năng nhận biết và liên kết với tế bào E. coli O157:H7.
5. Biểu hiện đƣợc đoạn gen mã hóa kháng thể scFv trên vector biểu hiện pET28a-TRX trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3). Kháng thể tái tổ hợp dạng dung hợp với TRX có trọng lƣợng phân tử khoảng 30,8 kDa. Tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp đã đƣợc kiểm tra bằng các phƣơng pháp Western Blot, Dot blot và ELISA.
6. Bƣớc đầu sử dụng phức hợp nano-kháng thể trong việc phát hiện E. coli
O157:H7 bằng phƣơng pháp soi dƣới kính hiển vi.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng của phức liên hợp nano-kháng thể trong việc phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7.
2. Tạo kit xác định vi khuẩn E. coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm và phân tích dựa trên kháng thể tái tổ hợp.
1. (2011) Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn
Escherichia coli O157:H7. Tạp chí Dinh dưỡng và Thực phẩm, 7(2):77- 81. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. (2011) Tách dòng và xác định trình tự gen Stx1 và Stx2 của vi khuẩn
Escherichia coli O157:H7 ở Việt Nam. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9 (1): 107- 111. 3. (2011) Sử dụng thƣ viện scFv trong nghiên cứu tạo dòng gen kháng thể kháng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7. Tạp chí Y học thực hành, (8): 434- 437.
4. (2012) Kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) - Hƣớng đi mới trong việc tạo kit phát hiện nhanh bệnh truyền nhiễm, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, 90(02): 43-49.
5. (2012) Phát triển kỹ thuật LAMP (Loop- mediated isothermal amplification) cho việc phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Escherichia coli O157:H7. Tạp chí Sinh học, 34(3): 343-346.
6. 01 trình tự gen 16s rRNA trên Ngân hàng Gen Quốc tế. (2011) Escherichia coli O157:H7 16S ribosomal RNA gen, partial sequence, EMBL, GenBank, Accession HQ658163.
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Giang An (2012), Nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng kháng polyhedrin nhằm ứng dụng chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán MBV ở tôm sú, luận án Tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. Lê Đình Chắc, Nguyễn Thị Thu Thủy và Lê Quang Huấn (2010), "Tạo kháng thể scFV đặc hiệu kháng nguyên CYFRA 21-1", Tạp chí Y học thực hành, 2, tr. 163-168.
3. Nguyễn Anh Diệp (2006), Nguyên tắc phân loại sinh vật, Nxb Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.
4. Trƣơng Nam Hải (2011), Salmonella: Kit chẩn đoán và vacxin trên cơ sở protein tái tổ hơp, Nxb Khoa học Tự nhiên và Kỹ thuật, Hà Nội.
5. Lê Quang Huấn và Lã Thị Huyền (2009), Kháng thể tái tổ hợp và ứng dụng, Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
6. Hoàng Thủy Nguyên, Hoàng Minh Tuyết, Trƣơng Uyên Ninh, Lê Văn Điệt, Lê Quỳnh Mai và Nguyễn Thị Thành (1994), "Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng virus Dengue type 1,2,3,4 và ứng dụng trong chẩn đoán nhanh sốt Dengue",Tạp chí vệ sinh phòng dịch, 4(3), tr. 106-107.
7. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt và Tô Long Thành (2012), "Xác định các gen độc tố và khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 phân lập đƣợc từ thịt bò ở khu vực Hà Nội", Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 19(6), tr. 20- 25.
8. Đỗ Thị Thảo, Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Thị Trang và Đỗ Thị Phƣơng (2010), "Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng alpha- fetoprotein (AFP) để hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thƣ tế bào gan ở ngƣời", Tạp chí Y học Việt Nam, 372(2), tr. 90-94.
9. Nguyễn Ngọc Tuân, Bùi Thị Thu Trang và Trần Thị Dân (2004), "Phát hiện gen eae, hly, stx1 và stx2 của Escherichia coli trên quầy thịt heo, phân heo và phân bò",Tạp chí KHKT Nông lâm nghiệp, 4, tr. 48-53.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
10. Azzazy H. M. E. and Highsmith W. E. (2002), "Phage display technology: clinical applications and recent innovations",Clin. Biochem., 35(6), pp. 425-445. 11. Bauwens A., Bielaszewska M., Kemper B., Langehanenberg P., von Bally
G., Reichelt R., Mulac D., Humpf H. U., Friedrich A. W., Kim K. S., Karch H. and Muthing J. (2011), "Differential cytotoxic actions of Shiga toxin 1 and Shiga toxin 2 on microvascular and macrovascular endothelial cells", Thromb. Haemost., 105(3), pp. 515-528.
12. Beddoe T., Paton A. W., Le Nours J., Rossjohn J. and Paton J. C. (2010), "Structure, biological functions and applications of the AB5 toxins", Trends Biochem. Scie., 35(7), pp. 411-418.
13. Beutin L. and Martin A. (2012), "Outbreak of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O104:H4 infection in Germany causes a paradigm shift with regard to human pathogenicity of STEC strains", J. Food. Prot., 75(2), pp. 408-418.
14. Bielaszewska M., Mellmann A., Zhang W., Kock R., Fruth A., Bauwens A., Peters G. and Karch H. (2011), "Characterisation of the Escherichia coli strain associated with an outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, 2011: a microbiological study",Lancet Infect. Dis., 11(9), pp. 671-676.
15. Bonyadian M., Momtaz H., Rahimi E., Habibian R., Yazdani A. and Zamani M. (2010), "Identification & characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from patients with diarrhoea in Iran",Indian J. Med. Res., 132, pp. 328-331.
16. Buchanan R. L. and Doyle M. P. (1997), "Foodborne Disease Significance of Escherichia coli O157:H7 and Other Enterohemorrhagic E. coli", Food. Technol., 51(10), pp. 69-76.
17. Bürk C., Dietrich R., Agar G., Moravek M., Bülte M. and Märtlbauer E. (2003), "Identification and Characterization of a New Variant of Shiga Toxin 1 in Escherichia coliONT:H19 of Bovine Origin", J. Clin. Microbiol., 41(5), pp. 2106- 2112.
18. Carlsson A., Wingren C., Ingvarsson J., Ellmark P., Baldertorp B., Ferno M., Olsson H. and Borrebaeck C. A. (2008), "Serum proteome profiling of metastatic breast cancer using recombinant antibody microarrays", Eur. J. Cancer, 44(3), pp. 472-480.
19. Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X. and Wang F. (2005), "Arthrobacter ardleyensis sp. nov., isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment",Arch. Microbiol., 183(4), pp. 301- 305.
20. Chinyu S. and Lawrence J. B. (1995), "Escherichia coli O157:H7 infecttion in humans",Ann. Intern. Med., 123(9), pp. 698-714.
21. Clackson T., Hoogenboom H.R., Griffiths A.D. and Winter G. (1991), "Making antibody fragments using phage display libraries", Nature, 352(6336), pp. 624-628.
22. Corisdeo S. and Wang B. (2004), "Functional expression and display of an antibody Fab fragment in Escherichia coli: study of vector designs and culture conditions",Protein Expr. Purif., 34(2), pp. 270-279.
23. Cortese R., Felici F., Galfre G., Luzzago A., Monaci P. and Nicosia A. (1994), "Epitope discovery using peptide libraries displayed on phage", Trends Biotechnol., 12(7), pp. 262-267. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
24. Devlin J. J., Panganiban L. C. and Devlin P. E. (1990), "Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules", Science, 249(4967), pp. 404-406.
25. di Marzo Veronese F., Willis A. E., Boyer-Thompson C., Appella E. and Perham R. N. (1994), "Structural mimicry and enhanced immunogenicity of peptide epitopes displayed on filamentous bacteriophage. The V3 loop of HIV-1 gp120",J. Mol. Biol., 243(2), pp. 167-172.
26. Fan K., Dai J., Wang H., Wei H., Cao Z., Hou S., Qian W., Wang H., Li B., Zhao J., Xu H., Yang C. and Guo Y. (2008), "Treatment of collagen-induced arthritis with an anti-osteopontin monoclonal antibody through promotion of apoptosis of both murine and human activated T cells", Arthritis. Rheum., 58(7), pp. 2041-2052.
27. Fraser M. E., Fujinaga M., Cherney M. M, Melton-Celsa A. R., Twiddy E. M., O’Brien A. D. and James M. N. G. (2004), "Structure of Shiga toxin type 2 (stx2) from Escherichia coli O157:H7", J. Biol. Chem., 279(25), pp. 27511-27517.
28. Friedrich A. W., Lu S., Bielaszewska M., Prager R., Bruns P., Xu J.G., Tschäpe H. and Karch H. (2006), "Cytolethal distending toxin in Escherichia coli O157:H7: spectrum of conservation, structure, and endothelial toxicity", J. Clin. Microbiol., 44(5), pp. 1844-1846.
29. Fuller C. A., Pellino C. A., Flagler M. J., Strasser J. E. and Weiss A. A. (2011), "Shiga toxin subtypes display dramatic differences in potency", Infect. Immun., 79(3), pp. 1329-1337.
30. García-Martínez J., Acinas S. G., Antón A. I. and Rodríguez-Valera F. (1999), "Use of the 16S--23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity",J. Microbiol. Methods., 36(1-2), pp. 55- 64.
31. Goto M., Honda E., Ogura A., Nomoto A. and Hanaki K. (2009), "Colorimetric detection of loop- mediated isothermal amplifcation reaction by using hydroxy naphthol blue",Bio. Techniques., 46(3), pp. 167-172. 32. Griffin A. D., Williams S. C., Hartley O., Tomlinson I. M., Warterhouse P.,
Crosby W. L., Kontermann R. E., Jones P. T., Low N. M. and Allison T. J. (1994), "Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires",EMBO J., 13(14), pp. 3245- 3260.
33. Gyles C. L. (2006), " An overview Escherichia coli: Shiga toxin-producing", J. Anim. Sci., 85(13), pp. E45- E62.
34. Hara-Kudo Y., Nemoto J., Ohtsuka K., Segawa Y., Takatori K., Kojima T. and Ikedo M. (2007), "Sensitive and rapid detection of Vero toxin-producing
Escherichia coli using loop-mediated isothermal amplification", J. Med. Microbiol., 56(Pt3), pp. 398–406.
35. Hien B. T., Scheutz F., Cam P. D., Serichantalergs O., Huong T. T., Thu T. M. and Dalsgaard A. (2011), "Diarrheagenic Escherichia coli and Shigella strains isolated from children in a hospital case-control study in Hanoi, Vietnam.",J. Clin. Microbiol., 46(3), pp. 996- 1004.
36. Hill H. R. and Stockley P. G. (1996), " Phage presentation", J. Mol. Biol., 20(4), pp. 685- 692.
37. Hoet R. M., Cohen E. H., Kent R. B., Rookey K., Schoonbroodt S., Hogan S., Rem L., Frans N., Daukandt M., Pieters H., van Hegelsom R., Neer N. C., Nastri H. G., Rondon I. J., Leeds J. A., Hufton S. E., Huang L., Kashin I., Devlin M., Kuang G., Steukers M., Viswanathan M., Nixon A. E., Sexton D. J., Hoogenboom H. R. and Ladner R. C. (2005), "Generation of high-affinity human antibodies by combining donor-derived and synthetic complementarity- determining-region diversity",Nat. Biotechnol., 23(3), pp. 344-348.
38. Hoogenboom H. R., Marks J. D., Griffin A. D. and Winter G. (1992), "Building antibodies from their genes",Immunol. Rev., 130, pp. 41- 68. 39. Huse W. D., Sastry L., Iverson S. A., Kang A. S., Alting-Mees M., Burton D.
R., Benkovic S. J. and Lerner R. A. (1992), "Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda. 1989",Biotech., 24, pp. 517-523.
40. Iturriza-Gomara M., Xerry J., Gallimore C. I., Dockery C. and Gray J.