:
3.4. TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA KHÁNG THỂ
vật khác. Những tiến bộ gần đây trong sự hiểu biết cơ bản của phiên mã, dịch mã, và quá trình cuộn xoắn protein trong vi khuẩn E. coli, cùng với những phát minh các công cụ cải thiện di truyền đang làm cho vi khuẩn này ngày càng có giá trị trong biểu hiện các protein có nguồn gốc từ các loài nhân chuẩn.
Quá trình biểu hiện một phân tử protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli phụ thuộc vào nhiều điều kiện khác nhau nhƣ nhiệt độ, thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng... Do vậy, việc thăm dò và xác định điều kiện biểu hiện là hoàn toàn cần thiết để thu đƣợc hàm lƣợng protein tái tổ hợp lớn nhất.
Sau khi thu đƣợc kháng thể tái tổ hợp, kháng thể đƣợc kiểm tra độ hòa tan và tinh sạch bằng phƣơng pháp hybrid bằng cột Ni-NTA của hãng Qiagen. Cuối cùng là đánh giá độ nhạy, tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp bằng các phƣơng pháp miễn dịch nhƣ lai Western blot, Dot blot, ELISA và tạo phức kháng thể- nano có thể soi phát hiện dƣới kính hiển vi.
3.4. TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP TỔ HỢP
3.4.1.
Cấu trúc kháng thể khi đƣợc biểu hiện ảnh hƣởng rất nhiều tới hoạt tính và khả năng bắt cặp với kháng nguyên đích. Do vậy, sau khi xác định đƣợc chủng biểu
hiện, nồng độ IPTG, thời gian và nhiệt độ biểu hiện, protein kháng thể tái tổ hợp . Để kiểm tra độ hòa tan chủng tế bào BL21
. Ba mẫu protein tổng số, protein hòa tan và protein cặn tế bào đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 10% (Hình 3.26).
H 3.26. Hình ảnh điện di SDS-PAGE k ủa kháng thể tái tổ hợp.
M: marker
30o 37oC
2: Protein không tan 30oC 37oC
30o 37oC
10% trên hình 3.26
30o 37oC p ở dạng dung hợp đều biểu hiện
.
Để có thể sử dụng protein tái tổ hợp phục vụ cho mục đích chẩn đoán, protein tái tổ hợp đƣợc tinh sạch. Do protein tái tổ hợp có 6 Histidine ở đầu N nên có ái lực cao với ion Ni2+ trên cột. Trong quá trình tinh chế, Imidazole đƣợc sử dụng nhƣ chất cạnh tranh Ni2+ trong phức hợp Ni2+-Histidine. Các protein gắn không đặc hiệu dễ dàng đƣợc loại bỏ qua các bƣớc rửa ở nồng độ Imidazol 25 mM. Sau đó protein tái tổ hợp đƣợc đẩy ra khỏi cột nhờ dung dịch đệm đẩy (Native Elution Buffer) có nồng độ
Imidazol cao là 250 mM và 500 mM. Đối với dung dịch đệm đẩy có nồng độ Imidazol 250 mM, 4 phân đoạn khác nhau đƣợc tiến hành thu, còn dung dịch đệm đẩy có nồng độ Imidazol 500 mM chỉ có 1 phân đoạn đƣợc thu. Do cấu trúc His-tag có thể bị cuộn xoắn vào trong lòng protein khi protein tái tổ hợp hình thành cấu trúc không gian, làm hạn chế sự hình thành liên kết Ni2+-Histidine, dẫn tới protein thu đƣợc sau khi tinh sạch là thấp, vì vậy phƣơng pháp Hybrid đƣợc sử dụng để đảm bảo thu đƣợc toàn bộ hàm lƣợng protein tái tổ hợp. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.27.
Hình 3.27. Hình ảnh kết quả điện di SDS-PAGE quá trình tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phƣơng pháp Hybrid
M: Marker protein
1: Imidazole 500mM(phân đoạn 2) 5: Imidazole 250mM (phân đoạn 2) 2: Imidazole 500mM(phân đoạn 1) 6: Imidazole 250mM (phân đoạn 1) 3: Imidazole 250mM (phân đoạn 4) 7: Dịch qua cột
4: Imidazole 250mM (phân đoạn 3) 8: Đệm Lysis đƣa lên cột
Dƣới điều kiện Hybrid, kháng thể tái tổ hợp sẽ bị biến tính, dƣới tác dụng của Ure protein sẽ tan hoàn toàn. Do vậy trong quá trình tinh sạch sẽ thu đƣợc nhiều kháng thể tái tổ hợp hơn.
, khi tiến hành tinh sạch thu lƣợng lớn và thẩm tích, protein sẽ đƣợc thu chủ yếu ở 3 phân đoạn này. Kết quả thu đƣợc trên bản điện di SDS-PAGE cho thấy kháng thể tái tổ hợp đã đƣợc thu nhận ở dạng tinh sạch, có kích thƣớc khoảng 30 kDa, tƣơng ứng
với kích thƣớc đã tính toán theo lý thuyết. Sau khi đƣợc tinh sạch, kháng thể tái tổ hợp sẽ đƣợc thẩm tích trong đệm PBS ở 4oC qua đêm và đƣợc đo OD280nm để xác định nồng độ. Nồng độ protein thu đƣợc là 0,5 mg/ml.
3.4.2.
lai blot
Để xác định kháng thể tái tổ hợp nhận đƣợc là protein dung hợp với TRX có gắn đuôi His-tag, kĩ thuật lai protein (Western blot) đã đƣợc thực hiện sử dụng kháng thể kháng His-tag với nồng độ pha loãng 1:2000. Kỹ thuật Western blot đƣợc thực hiện dựa trên phản ứng miễn dịch kháng nguyên-kháng thể. Vector biểu hiện pET28a-TRX có mang trình tự mã hóa cho đoạn His-tag để thuận tiện cho việc tinh sạch protein, vì vậy protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện cũng chứa 6 Histidine ở đuôi His-tag. Vì vậy có thể thực hiện phản ứng Western blot sử dụng kháng thể kháng His-tag để khẳng định sự biểu hiện và tạo cấu trúc đúng của protein tái tổ hợp (protein đích).
3.28. Hình ảnh điện di kết quả phản ứng Western blot của kháng thể tái tổ hợ -tag.
M: Marker protein 1: P
Những protein có đuôi His-tag sẽ bắt màu trên màng chuyển, còn các protein không có đuôi His-tag sẽ không xảy ra phản ứng với kháng thể kháng His-tag do đó không xuất hiện băng màu trên màng chuyển. Kết quả trên hình 3.28 cho thấy trên giếng 1 có xuất hiện 1 băng protein với kích thƣớc khoảng 30 kDa, tƣơng ứng với
kích thƣớc lý thuyết của kháng thể tái tổ hợp chứng tỏ kháng thể tái tổ hợp đã đƣợc biểu hiện và tinh sạch.
Hiện nay, kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho E. coli O157:H7 đã đƣợc thƣơng mại hóa sử dụng cho nghiên cứu, do đó rất thuận tiện để có thể so sánh độ đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp thu đƣợc với kháng thể chuẩn có mã số AB75244 (do Hãng
Abcam sản xuất). , phản ứng Dot blot
đƣợc tiến hành sử dụng kháng thể tái tổ hợp
E. coli mẫu E. coli ATCC (H 3.29).
3.29. Hình ảnh kết quả phản ứng Dot blot của kháng thể tái tổ hợp với kháng thể chuẩn mã số AB75244 (Hãng Abcam).
1: Mẫu v
2: Mẫu v E. coli O157:H7
3.29 nhận tái tổ hợp ặ E. coli E.coli O157:H7, cặp tái tổ hợp nồng độ ử dụng trong thí nghiệm thấp E. coli cặp cặp E. coli,
Dot blot là kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc sử dụng trong phát hiện, phân tích và xác định các phân tử sinh học nhƣ protein. So với các phƣơng pháp lai blot khác nhƣ Northern blot, Western blot hay Southern blot thì kỹ thuật Dot blot đơn giản hơn, không đòi hỏi máy móc, trang thiết bị chuyên biệt, thời gian tiến hành ngắn và không đƣa ra đƣợc nhiều thông tin về phân tử sinh học đang nghiên cứu. Dot blot chỉ có thể phát hiện kết quả “có” hay “không có” của các phân tử sinh học bằng các đầu dò hoặc các kháng thể. Dot blot cũng không đặc hiệu bằng các kỹ thuật khác nhƣ Western blot hay ELISA, chính vì vậy kỹ thuật này chỉ sử dụng để xác định hoạt tính ban đầu đối với các phân tử sinh học. Cần sử dụng các kỹ thuật đặc hiệu hơn nhƣ ELISA để khẳng định lại về kết quả phân tích.