:
3.2.2.Chọn dòng phage kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E.coli O157:H7
Kỹ thuật ELISA thƣờng đƣợc dùng để đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể biểu lộ trên phage với kháng nguyên đích. Nguyên lý kỹ thuật ELISA đối với kháng nguyên là E. coli O157:H7 đƣợc sơ đồ hóa (Hình 3.16).
Hình 3.16. Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật ELISA dùng trong xác định của phage với E. coli O157:H7.
Trong nghiên cứu này, vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc cố định trên khay ELISA 96 giếng, ủ mỗi giếng với dung dịch phage riêng biệt đã thu đƣợc (Phần 3.2.1.). Các dòng phage sẽ gắn với tế bào đích thông qua đoạn kháng thể bộc lộ trên nó. Theo lý thuyết, dòng phage càng gắn tốt với E. coli O157:H7 thì tín hiệu sẽ càng cao. Do đó, bằng kỹ thuật ELISA có thể định tính đƣợc độ nhạy của dòng phage thu đƣợc với E. coli O157:H7 dựa trên số đo mật độ quang học. Kháng thể có khả năng gắn kết cao với E. coli O157:H7 sẽ cho giá trị OD405nm cao hơn và ngƣợc lại.
37 dòng khuẩn lạc sau chọn lọc đƣợc tiến hành tách phage để thực hiện phản ứng ELISA đánh giá độ gắn kết. Kết quả nhận đƣợc cho thấy tất cả 37 dòng phage đƣợc chọn đều thể hiện khả năng gắn với E. coli O157:H7 qua phản ứng ELISA. Ngoại trừ dòng phage 20 có tín hiệu ELISA cao vƣợt trội, các dòng phage còn lại có kết quả trung bình và gắn khá đồng đều với E. coli O157:H7 (Hình 3.17). Điều này chứng tỏ sau 5 vòng sàng lọc, hỗn hợp phage thu đƣợc chứa chủ yếu các dòng phage có khả năng gắn với E. coli O157:H7.
Hình 3.17. Kết quả của phản ứng ELISA đánh giá ái lực của hỗn hợp phage vòng sàng lọc 5.
Từ kết quả trên, một số dòng phage có tín hiệu ELISA trung bình và cao (bao gồm cả dòng phage 20) từ lần phản ứng ELISA trƣớc đƣợc tiến hành chọn lọc bằng ELISA tiếp theo để phân tích khả năng gắn kết của từng dòng phage trên đích E. coli O157:H7 so với các đối chứng âm (giếng chứa PBS) và đối chứng dƣơng (giếng chứa vi khuẩn E. coli ATCC 25922). Kết quả xác nhận khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với tế bào E. coli O157:H7 (các dòng phage cao và trung bình) bằng kỹ thuật ELISA đƣợc thể hiện trong hình 3.18.
OD 405
Hình 3.18. Kết quả đánh giá ái lực của dòng phage 20 với tế bào E. coli O157:H7 và tế bào E. coli ATCC 25922
Kết quả trên hình 3.18 cho thấy hầu hết các dòng phage đƣợc chọn đều có tín hiệu ELISA cao hơn so với các giếng đối chứng âm và đối chứng dƣơng. Đặc biệt dòng phage 20 vẫn có kết quả cao hơn hẳn so với các giếng đối chứng và so với các dòng phage còn lại. Điều đó có thể nhận định rằng kháng thể phage thu nhận đƣợc có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157:H7.
Để nghiên cứu sâu hơn về bản chất của kháng thể phage đơn chuỗi thu nhận đƣợc, trình tự đoạn gen mã hóa kháng thể này đƣợc tiến hành xác định.