:
3.2.4.Giải trình tự gen mã hoá kháng thể
Trình tự gen mã hóa kháng thể trong vector pHEN2 đƣợc tiến hành xác định. Hình ả phân tích gen mã hóa đoạn kháng thểđƣợc trình bày trong Phụ lục 6. Kết quả giải trình tự thu đƣợc đoạn gen sau:
CTGNAATTCCTATTTCAGGAGACAGTCATAATGAAATACCTATTGCCTACG GCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTG
CAGCTGCAGGTCGACCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTC TGGCGGTAGTGCACTTCAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCCTCACTGACTGT GTCCCCAGGAGGGACAGTCACTCTCACCTGTGCTTCCAGCACTGGAGCAGT CACCAGTGGTTACTATCCAAACTGGTTCCAGCAGAAACCTGGACAAGCACC CAGGGCACTGATTTATAGTACAAGCAACAAACACTCCTGGACCCCTGCCCG GTTCTCAGGCTCCCTCCTTGGGGGCAAAGCTGCCCTGACACTGTCAGGTGT GCAGCCTGAGGACGAGGCTGAGTATTACTGCCTGCTCTACTATGGTGGAGC TATGGTATTTGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTGCGGCCGCACA TCATCATCACCATCACGGGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGA TCTGAATGGGGCCGCATAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATAC AGAAAAATTCA
Đoạn gen mã hóa cho kháng thể này có trình tự amino acid suy diễn nhƣ sau: MNTYCLRQPLDCYYSRPSRPWPRCSCRSTSSGGGGSGGGGSGGSALQAVVT QEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGYYPNWFQQKPGQAPRALIYSTSNK HSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCLLYYGGAMVFGGGTKLT VLGAAA
Đoạn gen mã hóa cho kháng thể có độ dài 623 bp (với tỉ lệ C+G là 54.98%) mã hóa cho một protein kháng thể gồm 159 amino acid. Đoạn kháng thể thu đƣợc không phải là đoạn scFv đầy đủ mà chỉ gồm toàn bộ chuỗi nhẹ (VL) nối với một phần chuỗi nặng (VH). Vùng linker nối giữa hai đoạn chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có trình tự amino acid là SSGGGGSGGGGSGGS.
Tính đặc hiệu của kháng thể nằm trong 6 vùng quyết định tính bổ trợ (complementarity determining region, CDR), vùng tạo hình dạng của vị trí gắn kết với kháng nguyên (mỗi chuỗi nặng hoặc chuỗi nhẹ chứa 3 vùng CDR). Khi sử dụng hệ xác định Kabat (cách xác định các CDR dựa trên trình tự kháng thể có sẵn) các vùng quyết định tính bổ trợ của chuỗi nhẹ của kháng thể đã đƣợc xác định lần lƣợt là CDR1 (ASSTGAVTSGYYPN), CDR2 (STSNKHS), và CDR3
(LLYYGGAMV).
Xét về mặt lý thuyết, khi tạo thƣ viện phage display, các vùng VH và VL đƣợc nối với nhau một cách ngẫu nhiên sau khi cắt bằng enzyme giới hạn rồi gắn
vào vector. Vì vậy, vẫn có thể xảy ra khả năng chỉ có vùng VH hoặc VL gắn với vector hoặc các vùng này không đầy đủ.
So sánh với các trình tự protein đã công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế cho thấy trình tự amino acid trong phân tử protein kháng thể có độ tƣơng đồng từ 65% đến 100% so với các trình tự kháng thể đã công bố. Trong đó trình tự amino acid của protein thu nhận đƣợc giống đến 98% so với trình tự vùng 4A trong chuỗi nhẹ của các globin miễn dịch dạng lambda ở ngƣời (Ig lambda chain V region 4A). Các phần khác nhau của hai trình tự tập trung chủ yếu vào các CDR. Nhằm tìm hiểu rõ hơn cấu trúc không gian, phân tử kháng thể tái tổ hợp đƣợc xây dựng cấu trúc 3D trên trang web www.sbg.bio.ic.ac.uk và www.ncbi.nlm.nih.gov (Hình 3.20).
A. Vùng khoanh tròn là vị trí gắn kết với kháng nguyên B. Đầu N → C: xanh → đỏ Kích thƣớc 3 chiều (Ao ): X:30,474; Y:30,140; Z:40,837
Hình 3.20. Cấu trúc 3D của kháng thể tái tổ hợp
Phân tích hình 3.20 có thể thấy cấu trúc của kháng thể tái tổ hợp chỉ là một phần của kháng thể, tuy nhiên vẫn chứa đầy đủ các vùng CDR, là những vùng chính quyết định sự bắt cặp giữa kháng nguyên và kháng thể. Phần có mầu vàng trên hình 3.20A là vùng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể, vùng này đƣợc tạo thành bởi 3 vùng CDR. Kết quả so sánh cho thấy phân tử kháng thể tái tổ hợp có cấu trúc giống với vùng biến đổi chuỗi nhẹ, hình 3D đƣợc xây dựng dựa trên cấu trúc mẫu d1f4xl1 (IgV chuỗi nhẹ Lambda). Trình tự giống đến 69% so với cấu trúc mẫu, độ tin tƣởng
3.20B .
Nhƣ vậy, cấu trúc phân tử của kháng thể tái tổ hợp hoàn toàn giống với các phân tử kháng thể khác. Sự khác nhau hầu hết nằm ở các vùng CDR, do vậy, mặc
dù giống nhau đến 98% 2% nhƣng sự khác nhau này cho thấy sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng thể tái tổ hợp với các kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn E. coli O157:H7.
Thảo luận
Kỹ thuật tạo kháng thể đơn dòng do Kohler và Milstein công bố từ năm 1975 [45] đã mở ra một hƣớng ứng dụng mới là việc sử dụng kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán nhiều bệnh nan y. Tuy nhiên, việc sử dụng các kháng thể đơn dòng vào mục đích điều trị các bệnh hiểm nghèo chỉ mới đƣợc bắt đầu trong những năm gần đây. Các kết quả thực nghiệm cho thấy kháng thể có bản chất chuột hoàn toàn cũng nhƣ dạng lai, dạng nhân hóa đều có nhiều điểm hạn chế. Bên cạnh đó, việc sử dụng toàn bộ phân tử kháng thể cồng kềnh đã gây ra nhiều phản ứng phụ do tác dụng của phần Fc.
Hiện nay, các kháng thể đơn dòng có bản chất (nguồn gốc) từ ngƣời ở dạng tái tổ hợp ngày càng đƣợc sử dụng nhiều do các ƣu điểm của chúng so với các kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng thông thƣờng [78]. Có nhiều phƣơng pháp tạo kháng thể tái tổ hợp nhƣ hybridoma, DNA tái tổ hợp... Và một trong các công nghệ đƣợc sử dụng nhiều để sản xuất kháng thể tái tổ hợp là phage display [75]. Mặc dù đã đƣợc mô tả từ rất lâu tuy nhiên, phage display vẫn là một phƣơng pháp hữu dụng trong việc sàng lọc các peptide, protein hay kháng thể đối với các protein đích. Với kỹ thuật phage display, các nhà khoa học đã tạo ra rất nhiều đoạn kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ ngƣời ở dạng tái tổ hợp có khả năng kháng lại một lƣợng lớn các loại kháng nguyên RNA, các kháng nguyên protein khác nhau, các peptide, các proteoglycan... [75]. Sainath và cộng sự (2013) đã sử dụng thƣ viện phage display để sàng lọc các đoạn peptide đối với các chủng vi khuẩn [80], hay Ma và cộng sự (2013) cũng sử dụng thƣ viện phage display để sàng lọc các đoạn peptide đặc hiệu đối với ung thƣ buồng trứng [51].
Kỹ thuật phage display tạo ra kháng thể có bản chất hoàn toàn từ ngƣời mà lại có giá thành rẻ, đơn giản và nhanh chóng hơn so với các kỹ thuật khác. Do vậy,
việc sử dụng kỹ thuật phage display để sàng lọc các đoạn kháng thể đối với E. coli
O157:H7 là phù hợp.
Sau khi thu đƣợc kháng thể tái tổ hợp, kháng thể sẽ đƣợc tạo dòng trong vector TOPO PCR 2.1 rồi chuyển sang vector biểu hiện pET28a-TRX. Tiếp theo, vector tái tổ hợp pET28a-TRX mang gen mã hóa kháng thể sẽ đƣợc biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) và tối ƣu hóa quá trình biểu hiện nhằm thu lƣợng protein kháng thể dạng dung hợp với TRX lớn nhất.