:
3.3.2.Thiết kế vector pET28a-TRX biểu hiện gen mã hóa kháng thể
đồng thời 2 enzyme Bam HindIII. Bên
cạnh đó vector pET28a- 2 enzyme Bam
HindIII (H 3.22A). Kết quả điện di trên hình 3.22A cho thấy sản phẩm cắt tƣơng đối sạch và đủ điều kiện tiến hành phản ứng ghép nối.
Tiếp 28a-
T4- ligase. Sản phẩm đƣợc biến nạp vào chủng E. coli
Vector tái tổ hợp pET28a-TRX mang gen mã hóa kháng thể đƣợc cắt đồng thời bằng 2 enzyme Bam HindIII trong 1h ở 37oC, sau đó sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.22B
, ở đƣờng chạy số 1 xuất hiện 1 băng có kích thƣớc khoảng 7 kb (tƣơng ứng với
kích thƣớc của vector pET28a- 400 bp
. A. M: Marker 1kb - - B. M: Marker 1kb C. M: Marker 1kb -
Hình 3.22. Thiết kế vector pET28a-TRX biểu hiện gen mã hóa kháng thể.
A. Bam HindIII;
B. ;
thƣớc 405 bp (Hình 3.22C), phù hợp với tính toán lý thuyết. Để kiểm tra chiều và khung đọc của gen, trình tự gen trong plasmid tái tổ hợp thu đã đƣợc tiến hành xác định. Kết quả xác định trình tự đƣợc xử lý bằng phần mềm FASTA cho thấy
).
, các kết quả nhận đƣợc chothấy gen mã hóa kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 đã đƣợc gắn vào vector pET28a-TRX theo đúng
chiều và kh TRX (15,950 kDa)
protein kháng thể thu đƣợc sau khi biểu hiện có kích thƣớc tính toán theo lý thuyết là khoảng 30,8 kDa.
3.3.3.
3.23. Hình ảnh điện di xác định d bằng điện di SDS-PAGE
M: Marker
1: Mẫu không cảm ứng ( )
- có cảm ứng bằng IPTG 0,4 mM.
Để nghiên cứu biểu hiện gen mã hoá kháng thể, vector pET28a-TRX tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng thể đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli chủng BL21
Để kiểm tra khả năng biểu hiện của dòng tế bào thu đƣợc, các mẫu đƣợc điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide (Hình 3.23 nhận đƣợc trên hình 3.23 mẫu không cảm ứng (đối chứng
âm), trong đó .
D .
3.3.4. các óa kháng thể
E. coli
thƣờng là 0,4 mM, trong khi nếu vector mang promoter T7 lac thì
1 mM [68]. Do vậy, nồng độ cảm ứng IPTG (nồng độ cuối) đã đƣợc tiến hành thử nghiệm ở các mức 1,5 mM. Các mẫu tế bào nuôi cảm ứng IPTG nồng độ khác nhau đƣợc thu tại cùng các thời điểm và điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.24.
H 3.24. Hình ảnh điện di SDS-PAGE x cảm ứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
biểu hiện kháng thể tái tổ hợp
M: Marker 0,7 mM
1: Mẫu không cảm ứng 1 mM
hình 3.24 y các 0,4 1,5 0,7 thể hiện màu . Vì 0,7 . 37o
. Đối chứng âm đƣợc sử dụng là dòng tế bào không cảm ứng. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.25.
H 3.25. Khảo sát biểu hiện của kháng thể tái tổ hợp.
A: Ở nhiệt độ 28oC, B: Ở nhiệt độ 30oC, C: Ở nhiệt độ 37oC M: Marker
2-7: cảm ứng sau 1- 6 giờ
A B
28oC đến 30o
37o E. coli BL21
(DE3) sinh 37oC. Đối với thời gian cảm
ứng, sau 2, 3, 4, 5 giờ
ũy
E. coli 37o
0,7 .
E.coli là một trong những hệ thống tế bào chủ đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để sản xuất các protein tái tổ hợp do có đặc điểm di truyền tốt hơn so với bất kỳ vi sinh vật khác. Những tiến bộ gần đây trong sự hiểu biết cơ bản của phiên mã, dịch mã, và quá trình cuộn xoắn protein trong vi khuẩn E. coli, cùng với những phát minh các công cụ cải thiện di truyền đang làm cho vi khuẩn này ngày càng có giá trị trong biểu hiện các protein có nguồn gốc từ các loài nhân chuẩn.
Quá trình biểu hiện một phân tử protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli phụ thuộc vào nhiều điều kiện khác nhau nhƣ nhiệt độ, thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng... Do vậy, việc thăm dò và xác định điều kiện biểu hiện là hoàn toàn cần thiết để thu đƣợc hàm lƣợng protein tái tổ hợp lớn nhất.
Sau khi thu đƣợc kháng thể tái tổ hợp, kháng thể đƣợc kiểm tra độ hòa tan và tinh sạch bằng phƣơng pháp hybrid bằng cột Ni-NTA của hãng Qiagen. Cuối cùng là đánh giá độ nhạy, tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp bằng các phƣơng pháp miễn dịch nhƣ lai Western blot, Dot blot, ELISA và tạo phức kháng thể- nano có thể soi phát hiện dƣới kính hiển vi.
3.4. TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP TỔ HỢP
3.4.1.
Cấu trúc kháng thể khi đƣợc biểu hiện ảnh hƣởng rất nhiều tới hoạt tính và khả năng bắt cặp với kháng nguyên đích. Do vậy, sau khi xác định đƣợc chủng biểu
hiện, nồng độ IPTG, thời gian và nhiệt độ biểu hiện, protein kháng thể tái tổ hợp . Để kiểm tra độ hòa tan chủng tế bào BL21
. Ba mẫu protein tổng số, protein hòa tan và protein cặn tế bào đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 10% (Hình 3.26).
H 3.26. Hình ảnh điện di SDS-PAGE k ủa kháng thể tái tổ hợp.
M: marker
30o 37oC
2: Protein không tan 30oC 37oC
30o 37oC
10% trên hình 3.26 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
30o 37oC p ở dạng dung hợp đều biểu hiện
.
Để có thể sử dụng protein tái tổ hợp phục vụ cho mục đích chẩn đoán, protein tái tổ hợp đƣợc tinh sạch. Do protein tái tổ hợp có 6 Histidine ở đầu N nên có ái lực cao với ion Ni2+ trên cột. Trong quá trình tinh chế, Imidazole đƣợc sử dụng nhƣ chất cạnh tranh Ni2+ trong phức hợp Ni2+-Histidine. Các protein gắn không đặc hiệu dễ dàng đƣợc loại bỏ qua các bƣớc rửa ở nồng độ Imidazol 25 mM. Sau đó protein tái tổ hợp đƣợc đẩy ra khỏi cột nhờ dung dịch đệm đẩy (Native Elution Buffer) có nồng độ
Imidazol cao là 250 mM và 500 mM. Đối với dung dịch đệm đẩy có nồng độ Imidazol 250 mM, 4 phân đoạn khác nhau đƣợc tiến hành thu, còn dung dịch đệm đẩy có nồng độ Imidazol 500 mM chỉ có 1 phân đoạn đƣợc thu. Do cấu trúc His-tag có thể bị cuộn xoắn vào trong lòng protein khi protein tái tổ hợp hình thành cấu trúc không gian, làm hạn chế sự hình thành liên kết Ni2+-Histidine, dẫn tới protein thu đƣợc sau khi tinh sạch là thấp, vì vậy phƣơng pháp Hybrid đƣợc sử dụng để đảm bảo thu đƣợc toàn bộ hàm lƣợng protein tái tổ hợp. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.27.
Hình 3.27. Hình ảnh kết quả điện di SDS-PAGE quá trình tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phƣơng pháp Hybrid
M: Marker protein
1: Imidazole 500mM(phân đoạn 2) 5: Imidazole 250mM (phân đoạn 2) 2: Imidazole 500mM(phân đoạn 1) 6: Imidazole 250mM (phân đoạn 1) 3: Imidazole 250mM (phân đoạn 4) 7: Dịch qua cột
4: Imidazole 250mM (phân đoạn 3) 8: Đệm Lysis đƣa lên cột
Dƣới điều kiện Hybrid, kháng thể tái tổ hợp sẽ bị biến tính, dƣới tác dụng của Ure protein sẽ tan hoàn toàn. Do vậy trong quá trình tinh sạch sẽ thu đƣợc nhiều kháng thể tái tổ hợp hơn.
, khi tiến hành tinh sạch thu lƣợng lớn và thẩm tích, protein sẽ đƣợc thu chủ yếu ở 3 phân đoạn này. Kết quả thu đƣợc trên bản điện di SDS-PAGE cho thấy kháng thể tái tổ hợp đã đƣợc thu nhận ở dạng tinh sạch, có kích thƣớc khoảng 30 kDa, tƣơng ứng
với kích thƣớc đã tính toán theo lý thuyết. Sau khi đƣợc tinh sạch, kháng thể tái tổ hợp sẽ đƣợc thẩm tích trong đệm PBS ở 4oC qua đêm và đƣợc đo OD280nm để xác định nồng độ. Nồng độ protein thu đƣợc là 0,5 mg/ml.
3.4.2.
lai blot
Để xác định kháng thể tái tổ hợp nhận đƣợc là protein dung hợp với TRX có gắn đuôi His-tag, kĩ thuật lai protein (Western blot) đã đƣợc thực hiện sử dụng kháng thể kháng His-tag với nồng độ pha loãng 1:2000. Kỹ thuật Western blot đƣợc thực hiện dựa trên phản ứng miễn dịch kháng nguyên-kháng thể. Vector biểu hiện pET28a-TRX có mang trình tự mã hóa cho đoạn His-tag để thuận tiện cho việc tinh sạch protein, vì vậy protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện cũng chứa 6 Histidine ở đuôi His-tag. Vì vậy có thể thực hiện phản ứng Western blot sử dụng kháng thể kháng His-tag để khẳng định sự biểu hiện và tạo cấu trúc đúng của protein tái tổ hợp (protein đích).
3.28. Hình ảnh điện di kết quả phản ứng Western blot của kháng thể tái tổ hợ -tag.
M: Marker protein 1: P
Những protein có đuôi His-tag sẽ bắt màu trên màng chuyển, còn các protein không có đuôi His-tag sẽ không xảy ra phản ứng với kháng thể kháng His-tag do đó không xuất hiện băng màu trên màng chuyển. Kết quả trên hình 3.28 cho thấy trên giếng 1 có xuất hiện 1 băng protein với kích thƣớc khoảng 30 kDa, tƣơng ứng với
kích thƣớc lý thuyết của kháng thể tái tổ hợp chứng tỏ kháng thể tái tổ hợp đã đƣợc biểu hiện và tinh sạch.
Hiện nay, kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho E. coli O157:H7 đã đƣợc thƣơng mại hóa sử dụng cho nghiên cứu, do đó rất thuận tiện để có thể so sánh độ đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp thu đƣợc với kháng thể chuẩn có mã số AB75244 (do Hãng
Abcam sản xuất). , phản ứng Dot blot
đƣợc tiến hành sử dụng kháng thể tái tổ hợp
E. coli mẫu E. coli ATCC (H 3.29).
3.29. Hình ảnh kết quả phản ứng Dot blot của kháng thể tái tổ hợp với kháng thể chuẩn mã số AB75244 (Hãng Abcam).
1: Mẫu v
2: Mẫu v E. coli O157:H7
3.29 nhận tái tổ hợp ặ E. coli E.coli O157:H7, cặp tái tổ hợp nồng độ ử dụng trong thí nghiệm thấp E. coli cặp cặp E. coli,
Dot blot là kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc sử dụng trong phát hiện, phân tích và xác định các phân tử sinh học nhƣ protein. So với các phƣơng pháp lai blot khác nhƣ Northern blot, Western blot hay Southern blot thì kỹ thuật Dot blot đơn giản hơn, không đòi hỏi máy móc, trang thiết bị chuyên biệt, thời gian tiến hành ngắn và không đƣa ra đƣợc nhiều thông tin về phân tử sinh học đang nghiên cứu. Dot blot chỉ có thể phát hiện kết quả “có” hay “không có” của các phân tử sinh học bằng các đầu dò hoặc các kháng thể. Dot blot cũng không đặc hiệu bằng các kỹ thuật khác nhƣ Western blot hay ELISA, chính vì vậy kỹ thuật này chỉ sử dụng để xác định hoạt tính ban đầu đối với các phân tử sinh học. Cần sử dụng các kỹ thuật đặc hiệu hơn nhƣ ELISA để khẳng định lại về kết quả phân tích.
3.4.3. Kiểm tra hoạt tính của kháng thể tái tổ hợp bằng ELISA
Để đánh giá độ nhạy của kháng thể tái tổ hợp tạo ra với vi khuẩn E. coli
O157:H7, phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên là vi khuẩn E. coli O157:H7, mẫu đối chứng là vi khuẩn ATCC và PBS đã đƣợc thực hiện (Bảng 3.4). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.4. Kết quả của phản ứng ELISA xác định độ nhạy của kháng thể tái tổ hợp và kháng thể chuẩn Kháng thể Mẫu OD 405nm Kháng thể tái tổ hợp Kháng thể chuẩn (AB75244) PBS1X 0,05 ± 1.10 -6 0,048 ± 3.10-6 ATCC 0,067 ± 2,33.10 -6 0,061 ± 0.000013 O157 0,59 ± 0,00026 0,78 ± 0,00079
Dựa vào kết quả trong bảng 3.4 có thể thấy cả kháng thể tái tổ hợp và kháng thể chuẩn đều không bắt cặp với vi khuẩn ATCC nhƣng bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157:H7, trong đó giá trị OD 405 nm đo đƣợc của kháng thể chuẩn cao hơn so với kháng thể tái tổ hợp.Kết quả này chứng tỏ kháng thể chuẩn có độ đặc hiệu cao hơn kháng thể tái tổ hợp. Để khẳng định sự sai khác giữa hai giá trị trung bình của hai loại kháng thể với vi khuẩn E. coli O157:H7 có ý nghĩa hay không, hàm T- test với số mẫu n =3 đã đƣợc sử dụng để kiểm tra.
Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm Excel, giá trị trung bình khi đo OD ở bƣớc sóng 405 nm của kháng thể tái tổ hợp là 0,59± 0,00026 và của kháng thể chuẩn là 0,78± 0,00079. Với hàm T-test kiểm tra 2 chiều thu ở mức α= 0,01 (với độ tin cậy là 99%) t= 27,428 > t0,01=9,92. Nhƣ vậy, sự sai khác về giá trị trung bình giữa hai mẫu là có ý nghĩa. Hay nói một cách khác, độ đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp tạo ra có ái lực thấp hơn so với kháng thể chuẩn của Hãng Abcam.
3.4.4. hạt nano
Các hạt nano gắn kháng thể có khả năng ứng dụng trong y sinh đặc biệt đối với quá trình điều trị và chẩn đoán. Trong điều trị, các ứng dụng chính của phức hợp nano-kháng thể là phát triển theo hƣớng phân phối thuốc đến mục tiêu đích, cùng với việc sửa chữa các mô. Trong chẩn đoán, ứng dụng của hạt nano-kháng thể có thể đƣợc sử dụng trong tế bào và sử dụng trong thí nghiệm invitro bao gồm yếu tố tƣơng phản trong chụp cộng hƣởng từ (Magnetic Resonance Imaging- MRI), cảm biến, chuyển gen, xét nghiệm miễn dịch....
Hình 3.30. Hình ảnh phức hợp kháng thể- silica bắt với tế bào E. coli O157:H7.
Các điểm sáng màu xanh là vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc bắt bởi phức kháng thể- silica khi soi ở độ phóng đại 60X dƣới kính hiển vi.
, độ đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp đã đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp gắn silica và soi dƣới kính hiện vi. Hạt nano silica chứa chất màu huỳnh quang FITC (SiO2-FITC) có kích thƣớc 60-80nm, nồng độ hạt là 4.1012 hạt/ml. Khi gắn kháng thể scFv, theo tính toán sẽ có khoảng 20 kháng thể/hạt nano. Phức hợp silica-kháng thể đƣợc nhuộm với vi khuẩn E. coli O157:H7 với đối chứng đƣợc sử dụng là vi khuẩn ATCC và chụp ảnh dƣới kính hiển vi điện tử ở độ phóng đại 60X (Hình 3.30).
Kết quả trên hình 3.30 cho thấy khi soi phức kháng thể-silica liên kết với vi khuẩn E. coli O157:H7 đã có rất nhiều điểm phát quang trên trƣờng kính. Điều đó chứng tỏ đã có nhiều kháng thể đã bám vào vi khuẩn E. coli O157:H7. Thí nghiệm cũng đƣợc tiến hành song song với đối chứng là vi khuẩn ATCC, tuy nhiên do kháng thể không bám vào vi khuẩn này, dẫn tới vi khuẩn không phát quang và không quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi.
Thảo luận
Hiện nay, kháng thể kháng E. coli O157:H7 đã đƣợc thƣơng mại hóa. Những kháng thể này đƣợc sử dụng nhƣ những kháng thể chuẩn để so sánh ái lực và độ đặc hiệu với các kháng thể tái tổ hợp đƣợc tạo ra. Việc so sánh này sẽ rút ngắn thời gian giúp cho các nhà khoa học
.
Kháng thể tái tổ hợp phage scFv cũng nhƣ các scFv tự đo đặc hiệu với E. coli
O157:H7 đƣợc tạo ra có lợi thế là các phân tử có bản chất ngƣời hoàn toàn. Khi ứng dụng kháng thể này trong chẩn đoán và điều trị sẽ giảm thiểu hiện tƣợng HAMA và các tác dụng phụ không mong muốn của phần Fc. Hơn nữa, kháng thể scFv này có bản chất là các kháng thể đơn dòng, do đó nó có đầy đủ khả năng ứng dụng giống nhƣ các kháng thể đơn dòng khác dùng trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị bệnh. Đặc biệt hơn, kháng thể scFv đƣợc sản xuất nhanh chóng, dễ dàng vào có giá thành rẻ cho nên việc ứng dụng chúng cũng đơn giản hơn rất nhiều.
Kháng thể tái tổ hợp scFv đặc hiệu E. coli O157:H7 tạo ra có thể dễ dàng thực hiện các phản ứng chẩn đoán chính xác vi khuẩn E. coli O157:H7 trong các mẫu nghiên cứu và các mẫu thực phẩm bằng các kỹ thuật nhƣ Dot blot, Western blot, ELISA ... Với kháng thể scFv tái tổ hợp đƣợc tạo ra, chúng tôi hy vọng kháng thể này có thể đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu sâu hơn, hƣớng tới phát triển kỹ thuật chẩn đoán và điều trị các bệnh liên quan tới vi khuẩn E. coli O157:H7.
KẾT LUẬN
1. Đã tách dòng và xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 ở Việt Nam với kích thƣớc là 1,5 kb. Trình tự 16S rRNA đã đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số HQ658163.
2. Đã tách dòng và xác định trình tự hai đoạn gen Stx1 và Stx2từ vi khuẩn E. coli O157:H7. Đoạn gen Stx1 và Stx2 có kích thƣớc tƣơng ứng là 151 bp và 205bp. Trình tự nucleotide của hai đoạn gen có độ tƣơng đồng trên 99% so