:
3.1.2. Sử dụng đoạn gen Stx1 và Stx2 để xác định E.coli O157:H7
3.1.2.1. Nhân bản đoạn gen Stx1 và Stx2
Gen Stx1 và Stx2, đƣợc khuếch đại từ DNA tổng số của E. coli O157:H7 sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu tƣơng ứng là Stx1F/Stx1R và Stx2F/Stx2R. Đối chứng âm đƣợc dùng là vi khuẩn DH5α. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.7).
Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 và Stx2.
M: marker 1kb
1: PCR với cặp mồi Stx1F/Stx1R đối với E. coli DH5α
2: PCR với cặp mồi Stx2F/Stx2R đối với E. coli DH5α
3: PCR với cặp mồi Stx1F/Stx1R đối với E. coli O157:H7
4: PCR với cặp mồi Stx2F/Stx2R đối với E. coli O157:H7
Kết quả điện di trên hình 3.7 cho thấy ở giếng số 1 và 2 không xuất hiện băng chứng tỏ E. coli DH5α không mang gen độc. Giếng số 3 xuất hiện một băng có kích thƣớc khoảng 180bp, tƣơng ứng với kích thƣớc của gen Stx1 theo tính toán lý thuyết. Ở giếng số 4 có một băng vạch sáng đậm có kích thƣớc khoảng 200 bp phù hợp với kích thƣớc của gen Stx2 nhƣ tính toán theo lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét. Tiếp theo, sản phẩm PCR đƣợc tiến hành tách dòng và xác định trình tự.
3.1.2.2. Chọn dòng gen Stx1 và Stx2 trong vector pJET1.2/blunt
Sản phẩm PCR nhân hai gen Stx1 và Stx2 đƣợc tách dòng và xác định trình tự bằng cách gắn trực tiếp vào vector pJET1.2/blunt, sau đó sản phẩm lai đƣợc biến
nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α không có độc tố Shiga toxin và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng thạch LB có bổ sung Ampicillin (100 µg/ml). Vector pJET1.2/blunt là một vector tách dòng dùng trong các nghiên cứu kỹ thuật di truyền có kích thƣớc 2974 bp. Vector này có vị trí tách dòng là đầu bằng, điều này làm tăng khả năng tách dòng của vector lên nhiều lần vì nó không phụ thuộc vào các trình tự giới hạn và hiệu quả cắt của các enzyme.
Với đặc điểm vector pJET1.2/blunt chỉ tách dòng các đoạn gen đầu bằng, do vậy Taq polymerase không sử dụng làm enzyme tổng hợp sản phẩm PCR, thay vào đó là Pfu polymerase của vi khuẩn Pyrococcus furiosis. Enzyme này có nhiều ƣu điểm hơn Taq polymerase thứ nhất là không gắn thêm một nucleotide adenine vào đầu 3’ của gen và thứ hai không có hoạt tính 5’-3’ exonuclease. Nhờ đặc điểm này sản phẩm PCR do Pfu polymerase tổng hợp sẽ có đầu bằng và mồi không bị phân hủy trong quá trình phản ứng.
Để chọn đƣợc dòng mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, plasmid của một số khuẩn lạc đối với từng gen sẽ đƣợc tách chiết và kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi của vector pJET1.2. Cặp mồi này sẽ khuếch đại đoạn trình tự nằm giữa vị trí đã tách dòng.
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen Stx1 với cặp mồi vector pJET.
M: Marker 1kb
Đối với Stx1, 2 dòng vi khuẩn đƣợc tách plasmid và chạy PCR. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (Hình 3.8) cho thấy cả hai giếng đều có 1 băng có kích thƣớc khoảng 250 bp, tƣơng ứng với tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, rõ nét và không có sản phẩm phụ.
Đối với gen Stx2, 5 dòng vi khuẩn đƣợc tách chiết plasmid và chạy PCR kiểm tra (Hình 3.9).
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx2 với cặp mồi vector pJET
M: marker 1kb
1-5: dòng khuẩn lạc số 1-5
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Stx2 trên gel agarose 1% trên hình 3.9 cho thấy các giếng số 1, 2, 4, 5 đều có 1 băng vạch sáng, rõ nét có kích thƣớc khoảng 300 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết. Riêng giếng số 3 không xuất hiện băng sản phẩm PCR, nhƣ vậy, có thể kết luận các dòng khuẩn lạc số 1, 2, 4, 5 có khả năng mang gen Stx2.
Để khẳng định kết quả tách dòng đối với 2 gen Stx1 và Stx2, plasmid của dòng số 1 mang gen Stx1 và dòng số 5 mang gen Stx2 đƣợc tinh sạch và giải trình tự.
3.1.2.3. Xác định trình tự đoạn gen Stx1 và Stx2 Xác định trình tự đoạn gen Stx1
Kết quả xác định trình tự (Phụ lục 4) cho thấy đoạn gen Stx1 có kích thƣớc là 150 bp, nằm ở tiểu phần A, tiểu phần có vai trò nhƣ một enzyme N-glycosidase. Kết quả so sánh trình tự thu đƣợc với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen Quốc
tế bằng phần mềm phân tích độ tƣơng đồng BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih) cho thấy, trình tự nucleotide thu đƣợc có độ tƣơng đồng đến 99% với các trình tự của đoạn gen Stx1 trong genome của các chủng vi khuẩn E. coli khác và với vi khuẩn
Shigella dysenteriae (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả so sánh trình tự gen Stx1 với các trình tự gen Stx1 từ GenBank
Description Max score Total score Query cover E
value Ident Accession
Escherichia coli strain EC169 antitermination protein Q (q), Shiga toxin 1 subunit A (Stx1A), and Shiga toxin 1 subunit B (Stx1B) gens, complete cds
270 270 99% 2e-69 99% JQ327854.1
Shigella dysenteriae Shiga toxin subunit A (StxA) gen,
partial cds 270 270 99% 2e-69 99% HM017965.1
Escherichia coli O26:H11 str. 11368 DNA, complete genome 270 270 99% 2e-69 99% AP010953.1
Escherichia coli strain N13844 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A) and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds
270 270 99% 2e-69 99% GQ429159.1
Escherichia coli strain N11355 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A) and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds
270 270 99% 2e-69 99% GQ429158.1
Escherichia coli strain N11354 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A) and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds
270 270 99% 2e-69 99% GQ429157.1
Escherichia coli strain N2688 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A) and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds
270 270 99% 2e-69 99% GQ429156.1
Escherichia coli strain 22813 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A)
and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds 270 270 99% 2e-69 99% GQ429155.1
Escherichia coli strain 20177 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A)
and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds 270 270 99% 2e-69 99% GQ429154.1
Escherichia coli strain EC108 Shiga toxin 1A subunit (Stx1A)
and Shiga toxin 1B subunit (Stx1B) gens, partial cds 270 270 99% 2e-69 99% EU754740.1
Kết quả phân tích, so sánh với trình tự gen Stx1 của vi khuẩn Shigella dysenteriae
nhƣ sau:
Shigella dysenteriae Shiga toxin subunit A (StxA) gen, partial cds Sequence ID: gb|HM017965.1|Length: 955 Number of Matches: 1
Score= 270 bits(146) Expect =2e-69 Identities = 149/150(99%) Gaps = 1/150(0%) Strand=Plus/Plus
Query 1 ATCTATCCCTCTGACATCAACTGCAAACAAATTATCCCCTGTGCCACTATCA-TCATCAG 59 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| Sbjct 240 ATCTATCCCTCTGACATCAACTGCAAACAAATTATCCCCTGTGCCACTATCAATCATCAG 181
Query 60 TAAAGACGTACCTCCTGATGAAATAGTCTGTAATGGAGTACCTATTGCAGAGCGAATGAC 119 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 180 TAAAGACGTACCTCCTGATGAAATAGTCTGTAATGGAGTACCTATTGCAGAGCGAATGAC 121 Query 120 ATTCAGCGAATCTACATACGTCTTTGCAGT 149 |||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 120 ATTCAGCGAATCTACATACGTCTTTGCAGT 91 Xác định trình tự đoạn gen Stx2
Kết quả phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen Stx2 đƣợc trình bày trong Phụ lục 5. Đoạn gen Stx2 thu đƣợc có kích thƣớc là 205 bp, cũng nằm ở tiểu phần A. Trình tự nhận đƣợc đƣợc so sánh với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần mềm phân tích độ tƣơng đồng BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih). Kết quả nhận đƣợc cho thấy trình tự nucleotide thu đƣợc có độ tƣơng đồng 99% với các trình tự của đoạn gen Stx2 của E. coli O157:H7 và các chủng vi khuẩn E. coli khác.
Bảng 3.3. Kết quả so sánh trình tự gen Stx2 với các trình tự gen Stx2 từ GenBank
Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident
GU983683.1 Escherichia coli Stx2 A subunit variant h (Stx2A) and
Stx2 B subunit variant h (Stx2B) gens, complete cds 370 370 100% 2e-99 99%
GU983682.1 Escherichia coli Stx2 A subunit variant i (Stx2A) and
Stx2 B subunit variant i (Stx2B) gens, complete cds 370 370 100% 2e-99 99%
FM998860.1 Escherichia coli Stx2vA and Stx2vB gens for Shiga
toxin 2v subunits A and B, strain TS27/08 370 370 100% 2e-99 99%
FM998841.1 Escherichia coli Stx2dA and Stx2dB gens for Shiga
toxin 2d subunits A and B, strain TS04/07 370 370 100% 2e-99 99%
GQ429172.1
Escherichia coli strain N15432 Shiga toxin 2 A subunit (Stx2A) and Shiga toxin 2 B subunit (Stx2B) gens, complete cds
370 370 100% 2e-99 99%
GQ429171.1
Escherichia coli strain N11682 Shiga toxin 2 A subunit (Stx2A) and Shiga toxin 2 B subunit (Stx2B) gens, complete cds
370 370 100% 2e-99 99%
GQ429169.1
Escherichia coli strain N11354 Shiga toxin 2 A subunit (Stx2A) and Shiga toxin 2 B subunit (Stx2B) gens, complete cds
370 370 100% 2e-99 99%
GQ429167.1
Escherichia coli strain N5545 Shiga toxin 2 A subunit (Stx2A) and Shiga toxin 2 B subunit (Stx2B) gens, complete cds
GQ429166.1
Escherichia coli strain N4854 Shiga toxin 2 A subunit (Stx2A) and Shiga toxin 2 B subunit (Stx2B) gens, complete cds
370 370 100% 2e-99 99%
So sánh với trình tự GU983683, là trình tự có độ tƣơng đồng cao nhất với trình tự thu đƣợc có kết quả nhƣ sau:
Escherichia coli Stx2 A subunit variant h (Stx2A) and Stx2 B subunit variant h (Stx2B) gens, complete cds
Score = 370 bits (200), Expect = 2e-99 Identities = 204/206 (99%), Gaps = 0/206 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 ATTAACCACACCCCACCGGGCAGTTATTTTGCTGTGGATATACTAGGGCTTGATGTCTAT 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| Sbjct 311 ATTAACCACACCCCACCGGGCAGTTATTTTGCTGTGGATATACGAGGGCTTGATGTCTAT 370 Query 61 CAGGCGCGTTTTGACCATCTTCCTCTGATTATTGAGCAAAATAATTTATATGTGGCCGGG 120 |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 371 CAGGCGCGTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAGCAAAATAATTTATATGTGGCCGGG 430 Query 121 TTCGTTAATACGGCAACAAATACTTTCTACCGTTTTTCAGATTTTACACATATATCAGTG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 431 TTCGTTAATACGGCAACAAATACTTTCTACCGTTTTTCAGATTTTACACATATATCAGTG 490 Query 181 CCCGGTGTGACAACGGTTTCCATGAC 206 |||||||||||||||||||||||||| Sbjct 491 CCCGGTGTGACAACGGTTTCCATGAC 516