Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.3.1. Kết quả giải trình tự gene của những chủng virus nghiên cứu
Theo nghiên cứu của von Messling et al. (2001) đã chỉ ra protein mã hóa từ gene P là vùng gene bảo thủ nhất của virus Care trong các nhánh phát sinh của một dòng virus Care (Carpenter et al., 1998). Nghiên cứu về gene P của virus Care rất hữu
ích cho việc phân tích dữ liệu sinh học phân tử. Do đó, trong nghiên cứu này, trình tự gene P của 3 chủng virus Care CDV1-PHN, CDV19-RHN, CDV28-HHN phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam đã được giải trình tự. Sản phẩm phản ứng RT-PCR của chủng virus Care nghiên cứu tương ứng với gene P được trình bày ở Hình 4.14 đều cho một vạch band sáng duy nhất phù hợp với kích thước thiết kế của cặp mồi.
Hình 4.14. Kết quả khuếch đại gene P phục vụ giải trình tự
Ghi chú: (Giếng M là maker 100bp. Giếng 1 là chủng CDV1-PHN, giếng 2 là chủng CDV19-RHN, giếng 3 là chủng CDV28-HHN)
Qua hình 4.14 nhận thấy vùng gene P của virus Care đã được nhân lên một cách đặc hiệu, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất, không có sản phẩm “giả” và không bị đứt gãy. Với kết quả như vậy đã chứng minh các cặp mồi được lựa chọn trong nghiên cứu là hoàn toàn đặc hiệu với vùng gene P trong hệ gene của virus Care. Đồng thời, chúng tôi thấy rằng toàn bộ qui trình phản ứng RT- PCR là chính xác từ việc thiết kế mồi, chu trình nhiệt, tiến trình thực hiện và kết quả phản ứng hoàn toàn đặc hiệu. Sau khi tiến hành kỹ thuật RT-PCR và thu được sản phẩm chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR bằng Kit để loại bỏ hết các thành phần dư thừa của phản ứng.
Kết quả giản đồ giải trình tự gene đoạn gene P (Hình 4.15) cho thấy chất lượng sản phẩm của quá trình giải trình tự gene tốt, mỗi đỉnh của giản đồ đều xác nhận một loại nucleotide, các nucleotide khác nhau thì sẽ tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng trong đó Adenin màu đỏ, Thymine màu xanh nước biển, Guanine màu xanh lá cây, Cytosine màu đen.
Hình 4.15. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide gen Phosphor protein của chủng virus CDV1-PHN
Chuỗi nucleotide thu được sau khi giải trình tự xử lý bằng các phần mềm phân tích trên máy tính. Sau khi phân tích chúng tôi thu được toàn bộ đoạn gene P của 3 chủng virus Care lựa chọn trong nghiên cứu có độ dài là 387bp. Các đoạn gene này được tham chiếu trên ngân hàng gene để kiểm tra chắc chắn là đoạn gene của virus Care.
Đồng thời, khi xem xét kết quả giải trình tự ở các đỉnh màu tương ứng với các vị trí nucleotide được giải trình tự, nhận thấy khoảng cách giữa các đỉnh là tương đối đồng đều, không xuất hiện các đỉnh có khoảng cách rộng hoặc nhiều đỉnh màu cùng tập trung tại một vị trí nucleotide.
Như vậy, việc tách chiết RNA tổng số, quá trình thực hiện RT-PCR và giải trình tự được thực hiện thành công
Kết quả này cho rằng việc giải trình tự gene trực tiếp từ sản phẩm của phản ứng RT-PCR là hoàn toàn thích hợp trong việc giải trình tự nhanh một đoạn gene của virus. Điều này sẽ rút ngắn thời gian so với việc giải trình tự một đoạn gene bằng cách nhân dòng gene qua tế bào vi khuẩn. Chuỗi trình tự sau khi giải trình tự gene được xử lý bằng phần mềm SEQ 8000 sau đó được lưu trữ trên hệ thống máy chủ để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Sau đó, các trình tự này được biểu diễn và phân tích bằng phần mềm Bioedit và MEGA version 6. Đồng thời, các trình tự gene sau khi giải trình tự gene được kiểm tra bằng phương pháp
Blast qua ngân hàng gene thế giới nhằm khẳng định chính xác trình tự gene giải trình tự được là virus Care và ở đoạn gene mong muốn.