Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.2. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2018 tới tháng 6/2019.
3.3. ĐỐI TƢỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Chó mắc bệnh care, chưa tiêm phòng vacxin được thu thập từ 5 tỉnh phía bắc Việt Nam: Thái Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Hà Nội, Hà Giang. Thông tin về nguồn gốc của chó nghiên cứu theo giống chó và địa phương được trình bày trong bảng 3.1, 3.2.
Bảng 3.1. Chó mắc bệnh care theo các giống chó khác nhau
STT Giống chó Số chó nghiên cứu
1 Phú Quốc (PQ) 4 2 H’ Mông cộc (MC) 6 3 Bắc Hà (BH) 12 4 Fox (F) 8 5 Becgie (B) 7 Tổng 37
Bảng 3.2. Chó mắc bệnh care theo địa phƣơng nghiên cứu khác nhau
STT Địa phƣơng lấy mẫu Số chó nghiên cứu Tên mẫu
1 Thái Bình 8 Từ TB01-TB08
2 Hải Dương 6 Từ HD01-HD06
3 Hưng Yên 6 Từ HY 01-HY06
4 Hà Nội 10 Từ HN01-HN10
5 Hà Giang 7 Từ HG01-HG07
+ Mẫu virus Care phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm của chó mắc bệnh Care thu thập được từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam.
+ Hoá chất sử dụng tách chiết RNA tổng số (kit QIAamp Viral RNA Minikit), kit chạy phản ứng RT-PCR (Kit Qiagen One-step RT-PCR), cặp mồi gene P (do công ty Greiner-bio-one Nhật Bản cung cấp, số lot: P10A010001) (Bảng 3.3), DW2, TBE, Ethidium bromide, agarose, DNA Marker (Bionexus – Mỹ), bộ kít DNeasy Blood & Tissue và hóa chất do hãng Qiagen cung cấp dùng để tách chiết DNA tổng số, Bộ kít Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen) dùng cho phản ứng PCR, kit tinh sạch sản phẩm PCR do hãng Bioneer cung cấp, bộ Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS) Quick Start Kit (Beckman Coulter).
Bảng 3.3. Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR và giải trình tự gene P
Gene Cặp mồi Trình tự mồi(5’-3’) Vị trí
P Upp1 ATGTTTATGATCACAGCGCGGT 2132-2149
P Upp2 ATTGGGTTGCACCACTTGTC 2560-2541
Nguồn: Lan et al. (2005c)
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của những chủng virus Care phân lập đƣợc phân lập đƣợc
- Phân lập virus trên môi trường tế bào, xác định một số đặc tính sinh học của virus;
- Nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của những chủng virus Care phân lập được;
- Nghiên cứu xác định hiệu giá virus của những chủng virus Care phân lập được;
- Nghiên cứu xác định biểu đồ tăng trưởng của những chủng virus Care phân lập được.
3.4.2. Nghiên cứu một số đăc điểm sinh học phân tử của những chủng Virus Care phân lập đƣợc Care phân lập đƣợc
- Nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide gene P của những chủng virus nghiên cứu;
- Nghiên cứu so sánh trình tự axit amin gene P của những chủng virus nghiên cứu;
- Nghiên cứu so sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide gene P giữa những chủng virus nghiên cứu;
- Nghiên cứu so sánh mức độ tương đồng về trình tự axit amin gene P giữa những chủng virus nghiên cứu;
- Nghiên cứu xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ phát sinh loài.
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được các nội dung đã đề ra của đề tài, chúng tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện đại trong lĩnh vực thú y.
3.5.1. Phƣơng pháp quan sát, thống kê sinh học, xử lý số liệu bằng phần mềm excel
Để xác định được các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc Care, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của chó từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên. Đồng thời dựa vào các đặc điểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan. Tiến hành phân tích, thống kê để đưa ra những kết quả chính xác. Xác định chính xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
3.5.2. Phƣơng pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể
Mổ khám ca bệnh nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức của chó mắc bệnh Care, cần tiến hành mổ khám những chó có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh. Chó bệnh được cố định cẩn thận, thu dịch swab (các dịch tự nhiên của cơ thể như nhử mắt, nước mũi, dịch ngoáy hầu họng. Chó mắc bệnh được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, được mổ khám theo quy trình như sau:
- Mổ khám xoang ngực: Trước tiên lột bỏ hết cơ ngực, sau đó dùng kéo cắt xương cắt một đường bắt đầu từ đầu dưới xương sườn thứ nhất đến đầu dưới của xương sườn cuối cùng, rồi cắt rời xương ức ra khỏi cơ hoành, phế mạc giữa và bao tim. Kiểm tra các vị trí và mặt ngoài các cơ quan xoang ngực: trạng thái tim, trạng thái phổi và các bộ phận liên quan đến màng tim và phổi như hạch phổi là chủ yếu.
- Mổ khám xoang bụng: Rạch một đường thẳng bên trái từ mỏm xương kiếm xuống đến sát hậu môn. Cắt từng lớp da ở bụng và các tổ chức liên kết ra. Nếu bụng chướng to thì phải lấy ngón tay hoặc vật cùn làm thủng màng bụng, luồn ngửa hai ngón tay trỏ và ngón giữa của tay trái vào xoang bụng, tay phải cầm ngửa lưỡi dao luồn vào kẽ hai ngón tay trái đó rồi vạch vách màng bụng theo hướng từ trên xuống dưới. như vậy tránh được làm rách dạ dày và ruột. Kiểm tra các cơ quan ở xoang bụng: lách, gan, dạ dày, ruột, thận và tuyến thượng thận...
+ Các cơ quan vùng xoang chậu: Cơ quan sinh dục đực: bao dịch hoàn,
âm nang, qui đầu, niệu đạo… Khí quan sinh dục cái: tương mạc từ cung, màng cheo và tổ chức liên kết xung quanh niệu quản, lâm ba quản và hoạch lâm ba. Mổ tử cung và âm đạo để quan sát màu sắc, độ rắn, lở loét, sẹo… Bàng quang (bóng đái): trạng thái tương mạc, số lượng và tính chất của chất chứa bên trong, trạng thái niêm mạc bàng quang. Trực tràng: kiểm tra tương mạc, niêm mạc và trạng thái phân bên trong.
- Mổ kiểm tra hộp sọ và não: Cố định đầu con vật rồi lột da và cơ vùng trán rồi cưa một đường ngang sau lồi xương đỉnh, sau đó từ hai bên xương đỉnh men theo xương thái dương hai bên tới giáp phần dưới mũi. Lấy dao nạy xương sọ theo các đường cắt để bộc lộ não. Dùng ngón tay luồn dưới não nhẹ nhàng nâng não lên, dùng chuôi dao luồn xuống dưới bẩy nhẹ não lên đế lấy cho dễ. Sau đó luồn kéo cắt đứt các dây thần kinh khác.
3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus Care trên môi trƣờng tế bào Vero-DST
Bước 1 chuẩn bị tế bào phân lập: Tế bào Vero – DST được đưa vào nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp, môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung 5% FCS (Fetal calf serum) làm ấm trong tủ 37OC trong 30 phút trước khi gây nhiễm virus.
Bước 2 chuẩn bị mẫu phân lập: Mẫu bệnh phẩm được nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau đó được đồng nhất trong dung dịch MEM. Tiến hành ly tâm tốc độ cao và lọc hỗn dịch, sau đó gây nhiễm vào tế bào Vero – DST.
Bước 3 gây nhiễm virus và quan sát kết quả: Từ các đĩa lồng tế bào đã chuẩn bị ở bước 1 hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100 µl mẫu đã chuẩn bị ở bước 2. Tế bào gây nhiễm virus được ủ ở 370C với 5% CO2 trong 30 phút. Bổ sung 1,5 ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB (Tryptose Phosphate Broth) vào đĩa lồng và để ở 370C với 5% CO2. Hàng ngày theo dõi sự phá hủy tế bào bằng kính hiển vi soi nổi và thu virus khi tế bào bị phá hủy đạt 80% - 90% diện tích đáy của đĩa lồng.
3.5.4. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml)
Tế bào Vero-DST được chuẩn bị trên khay 96 giếng (2,0 x 104 tế bào/giếng). Huyễn dịch virus được pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp các giếng theo thứa tự đánh dấu trước (25µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau khi ủ 1 giờ, dung dịch duy trì DMEM (10% TBP) được bổ sung vào (100 µl/giếng). CPE được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm. Giá trị TCID50/ml được xác định theo phương pháp của Behrens-Karber (Lan et al., 2005a).
3.5.5. Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn sự nhân lên của virus
Chuẩn bị các khay 96 giếng nuôi cấy tế bào Vero-DST với số lượng đảm bảo 5×104
tế bào/giếng.
Virus Care phân lập được và chủng virus vacxin được gây nhiễm lên tế bào với giá trị MOI = 0,01. Sau một giờ ủ, tiến hành rửa bằng 0.5 ml dung dịch PBS. Sau đó, bổ sung vào môi trường nuôi cấy (100µl/giếng) môi trường dinh dưỡng thiết yếu.
Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong tế bào được thu riêng từ dịch nổi và phần tế bào còn lại ở các bình gây nhiễm tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm virus.
Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus. Đường biểu biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log10 của TCID50 tại mỗi thời điểm thu virus.
3.5.6. Phƣơng pháp Chẩn đoán phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đoán nhanh
Xét nghiệm này dựa vào nguyên lý ELISA để phát hiện kháng nguyên của CDV. Đầu tiên dùng tăm bông vô trùng thấm dịch mắt và mũi của chó, cho tăm
mẫu trong ống nghiệm, để lắng trong 1 phút cho phần cặn lắng xuống đáy ống. Xé bao đựng thiết bị xét nghiệm, đặt lên mặt phẳng. Dùng ống hút hút dịch nổi, nhỏ 3 – 4 giọt vào vùng S (vị trí nhỏ mẫu). Đọc kết quả sau 5 – 10 phút (hình 1). Kết quả dương tính khi xuất hiện hai vạch màu đỏ (test line) ở vị trí T và C (hình 1), kết quả âm tính khi chỉ xuất hiện vạch màu đỏ ở vạch đối chứng C Xét nghiệm cần được thực hiện lại khi vạch đối chứng C không xuất hiện.
3.5.7. Phƣơng pháp RT-PCR và PCR
3.5.7.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Từ các mẫu bệnh phẩm thu được của các chó nghi mắc bệnh Care, được bảo quản trong điều kiện -800
C, tiến hành tách chiết RNA của virus để chẩn đoán các chó mắc bệnh.
Quy trình tách chiết RNA tổng số được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ Kit QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen, Hilden, Đức) với các bước thực hiện như sau:
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit.
Bước 1: Hút 560μl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5ml;
Bước 2: Thêm 140μl dung dịch mẫu đã xử lý là hỗn dịch (chứa virus và
dung dịch PCS cho vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm) vào ống Eppendorf trên, sau đó đồng hóa trong 15 giây;
Bước 3: Ly tâm để lắng mẫu xuống đáy ống Eppendorf;
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút;
Bước 5: Thêm 560 μl dung dịch Ethanol (96 – 100o), đồng hóa 15 giây và
ly tâm để lắng mẫu nhằm loại bỏ các giọt trên nắp;
Bước 6: Chuyển 630μl huyễn dịch trên sang cột QIAamp spin (cột lọc).
Lytâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ dịch dưới;
Bước 7: Lặp lại bước 6 với phần dịch còn lại;
Bước 8: Thêm 500μl dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút
rồi giữ cột, bỏ nước dưới;
Bước 9: Thêm 500μl dung dịch AW2, ly tâm 14000 vòng/phút, trong 3 phút, giữ cột, bỏ nước dưới. Sau đó ly tâm lại thêm một lần nữa 14000vòng/phút, trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn AW2;
Bước 10: Chuyển cột lọc sang một ống Eppendorf mới. Thêm 60μl dung dịch AVE để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút (để làm tan RNA trên màng xuống ống eppendorf mới). Sau đó ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới. Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số. Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20oC hoặc -80o
C.
3.5.7.2. Phương pháp RT-PCR và PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT-PCR theo bộKit Qiagen One-step RT-PCR với các thành phần cần cho một phản ứng như sau:
Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) 2X Reaction Mix 12.5 12.5 Mẫu RNA 5.0 Primer Forwad 0.5 Primer Reverse 0.5
RT/Platium Taq Mix 0.5
Nước cất 6.0
Tổng thể tích 25
Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR theo Lan et al. (2005b) gồm mồi mồi nhân đoạn gene P (Upp1; Upp2).
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt được trình bày ở bảng sau:
Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR
Giai đoạn Bƣớc tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 Tổng hợp c DNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút Duỗi mạch 95 30 giây 2 Gắn mồi 50 60 giây 35 Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
3.5.8. Phƣơng pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene
Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y. Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gene tự động là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger.
Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau:
Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR:
Bước 1: Cho vào ống Eppendorf sản phẩm RT-PCR và dung dịch PB theo
tỷ lệ 1:5 sau đó trộn đều.
Bước 2: Cho hỗn hợp đã trộn vào cột QIA đem ly tâm 13.000 vòng/phút
trong vòng 1 phút.
Bước 3: Cho 750μl PE vào cột QIA đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Bỏ dung dịch ở đáy ống. Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút.
Bước 4: Chuyển cột sang ống Eppendorf mới. Cho thêm 50 μl EB vào giữa màng để 1 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút (có thể lặp lại 1 lần nữa để đảm bảo lấy hết DNA).
Bước 5: Bỏ cột, lấy dung dịch ở ống Eppendorf (DNA tinh khiết).
Thực hiện phản ứng PCR sequence
Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml theo bảng sau:
Thành phần Thể tích cho 1 phản
ứng (µl)
DTCS Quick Start Master Mix 8,0 8,0
DNA 5,0
Primer 0,2
dH2O 6,8
Với chương trình chạy PCR giải trình tự sau
Bƣớc tổng hợp Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Biến tính chuỗi DNA 960 C 20 giây
30 chu kỳ
Gắn mồi 500 C 20 giây
Kéo dài chuỗi DNA 600 C 4 phút
Giữ sản phẩm ở 40 C
3.5.9. Xử lý số liệu
Phân tích xác nhận chuỗi gene thu được thông qua chương trình Blast trên Ngân hàng gene (GeneBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Truy cập ngân hàng gene thu nhận và xác định sự tương đồng về nucleotide của các chuỗi gene tương ứng của virus với các phân đoạn gene thu được trong nghiên cứu qua chương trình Bioedit. Thành phần axit amin của kháng nguyên virus được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (Bộ mã vi khuẩn – bacterial code) có trong ngân hàng gene và so sánh thông qua chương trình MEGA6. So sánh mức độ tương đồng về nucleotide giữa những chủng virus Care nghiên cứu với việc sử dụng các chủng virus Care tham chiếu được lấy từ ngân hàng gene thế giới, xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gene của chủng virus thu nhận được bằng phần mềm MEGA6.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. THU THẬP MẪU CHÓ MẮC BỆNH CARE VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR KỸ THUẬT RT-PCR
4.1.1. Kết quả chẩn đoán chó mắc bệnh Care bằng phƣơng pháp RT-PCR
Sau khi tiến hành theo dõi triệu chứng lâm sàng của các nhóm chó nghi mắc Care ở các lứa tuổi khác nhau tại nhiều địa phương: Thái Bình, Hưng Yên, Hải Dương, Hà Nội, Hà Giang chúng tôi Sử dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định