Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.3.3. Kết quả so sánh trình tự axitamin của những chủng virus nghiên cứu
Những sai khác về trình tự nucleotide của bộ ba mã hóa có thể dẫn đến những sai khác về thành phần axit amin (cứ 3 nucleotide mã hóa cho một axit amin - 3 nucleotide này được gọi là bộ 3 mã hóa) tuy nhiên cũng có những sự thay đổi về nucleotide mà không dẫn đến sự thay đổi về axit amin do một số axit amin có thể do nhiều bộ ba nucleotide cùng mã hóa. Chính vì vậy đôi khi sự sai khác về nucleotide lại không dẫn đến sự sai khác về axit amin nên không làm thay đổi cấu trúc của protein được mã hóa bởi gene. Tuy nhiên có những sai khác về nucleotide sẽ dẫn đến những sai khác trong bộ ba mã hóa và hệ quả là sự sai khác axit amin và có thể thay đổi cả tính chất của protein được tạo ra bởi axitamin này và đây là nguyên nhân phát sinh các biến dị di truyền thay đổi cả tính gây bệnh của virus. Để nghiên cứu toàn diện về đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus Care nghiên cứu thì sau khi xác định được trình tự nucleotide cần xác định tiếp thành phần axit amin của đoạn gene đó để có kết quả chính xác về sự biến đổi ở mức độ phân tử của các chủng virus Care phân lập.
Hình 4.17. Kết quả so sánh trình tự axitamin gen P của 3 chủng CDV nghiên cứu chủng CDV nghiên cứu
Ghi chú: Các vị trí amino acid giống nhau được biểu thị bằng dấu (.); các vị trí có sự sai khácđược
biểu thị bằng amino acid tương ứng ở chủng virus đó. Trong đó các kí hiệu amino acid là: Alanine: A; Aspartic acid hoặc Asparagine: B; Cysteine: C; Aspartic acid: D; Glutamic acid: E; Phenylalanine: F; Glycine: G; Histidine: H; Isoleucine: I; Lysine: K; Leucine: L; Methionine: M; Asparagine: N; Proline:
P; Glutamine: Q; Arginine: R; Serine: S; Threonine: T; Valine: V; Tryptophan: W; Tyrosine: Y; Glutamic acid hoặc glutamine: Z.
Kết quả ở hình 4.17, cho thấy 3 chủng virus nghiên cứu và chủng virus vacxin có trình tự axit amin mã hóa từ gene P có độ dài là 129 axit amin. Khi so sánh giữa 3 chủng virus nghiên cứu thu được số lượng vị trí sai khác lần lượt là:
- Chủng CDV1-PHN có 7 vị trí sai khác với chủng CDV19-HHN lần lượt là: 2, 17, 19, 32, 56, 61, 128
- Chủng CDV1-PHN có 8 vị trí sai khác với chủng CDV28-RHN lần lượt là: 2, 9, 17, 19, 32, 33,56, 61.
- Chủng CDV28-RHN có 3 vị trí sai khác với chủng CDV19-HHN lần lượt là: 9, 32, 133.
(Giải thích: axit amin 2 có nghĩa là có sự sai khác về axit amin ở vị trí thứ 2 trong trình tự 129 axit amin theo thứ tự của trình tự axit amin thu nhân được).
Khi so sánh giữa kết quả các vị trí sai khác về trình tự axit amin và trình tự nucleotide giữa 3 chủng virus nghiên cứu, nhận thấy có sự sai khác. Điều này có thể được lý giải là do có nhiều bộ ba nucleotide cùng mã hóa cho một axit
amin duy nhất, do đó dẫn đến sự sai khác khi so sánh giữa kết quả so sánh về trình tự nucleotide và axit amin giữa các chủng virus Care nghiên cứu.
So sánh kết quả nghiên cứu này với kết quả nghiên cứu của Iwatsuki et al. (1997); Lan et al. (2005c, 2006a, 2006b, 2007, 2009a). Điều này cho thấy không có sự thay đổi về số lượng vị trí chứa cysteine trên các chủng virus Care đã được phân lập trước đây và 3 chủng mới được phân lập trong nghiên cứu này.
4.3.4. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide giữa những chủng virus nghiên cứu
Qua kết quả giải trình đoạn gene P của các chủng virus Care nghiên cứu, tiến hành thu thập và xử lý bằng chương trình MEGA6 để so sánh mức độ tương đồng về nucleotide giữa các chủng nghiên cứu và tham chiếu với chủng virus vacxin. Kết quả được trình bày ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene P giữa những chủng virus Care nghiên
Chủng virus CDV CDV1-PHN CDV19-RHN CDV28-HHN
CDV1-PHN 100,0
CDV19-RHN 93,6 100,0
CDV28-HHN 93,0 99,4 100,0
Qua kết quả ở bảng 4.9 cho thấy 3 chủng virus nghiên cứu có mức độ tương đồng về nucleotide ở gene P đạt tỷ lệ khá cao lần lượt là 93,00%, 93,6 - 99,4%. Trong đó:
- Ở gene P thì 2 chủng CDV1-PHN và CDV19 –RHN có mức độ tương đồng là 93,6%; 2 chủng CDV1-PHN và CDV28-HHN có mức độ tương đồng là 93,0% . chủng CDV19-RHN và CDV28-HHN có mức độ tương đồng tương đối cao là 99,75%; Điều này cho thấy sự gần gũi trong mối quan hệ di truyền giữa chủng virus CDV19-RHN và CDV28-HHN trong nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu này tương đương với kết quả nghiên cứu của Lan et al. (2006a) và Guo et al. (2013) về tỷ lệ tương đồng nucleotide.
4.3.5. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự axit amin giữa những chủng virus nghiên cứu
Dùng phần mềm MEGA6 để phân tích sự tương đồng về trình tự axit amin của 3 chủng virus Care nghiên cứu với nhau. Dựa trên sự mã hóa nên các axit amin tương ứng gene P, phần mềm đã phân tích và kết quả được trình bày ở bảng 4.10.
Bảng 4.10. Sự tƣơng đồng về axit amin mã hóa từ gene P giữa những chủng virus nghiên cứu
Chủng virus CDV CDV1-PHN CDV19-RHN CDV28-HHN
CDV1-PHN 100,0
CDV19-RHN 90,1 100,0
CDV28-HHN 88,1 98,0 100,0
Kết quả cho thấy 3 chủng virus CDV nghiên cứu có mức độ tương đồng về axit amin tương ứng ở gene P đạt tỷ lệ khá cao lần lượt là 88,01% - 90,1% và 98,0%.
Trong đó:
Ở gene P thì 2 chủng CDV1-PHN và CDV19 –RHN có mức độ tương đồng là 80,1%; 2 chủng CDV1-PHN và CDV28-HHN có mức độ tương đồng là 90,10%. 2 chủng CDV19-RHN và CDV28-HHN có mức độ tương đồng tương đối cao là 98,00%; Kết quả nghiên cứu này thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của Lan et al. (2006a) khi chỉ ra mức độ tương đồng về gene P giữa 3 chủng P94S, Ac96I và S124C thuộc genotype Asia 1. Nhưng tương đương với kết quả nghiên cứu của Guo et al. (2013) chỉ ra mức độ tương đồng về gene P giữa các chủng virus Care thuộc genotype Asia 1.
4.3.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử
Sau khi so sánh mức độ tương đồng về nucleotide giữa những chủng virus Care nghiên cứu và dựa vào phần mềm MEGA6 tiến hành xây dựng cây sinh học phân tử để xác định và phân tích nguồn gốc phát sinh của các chủng virus nghiên cứu với việc sử dụng các chủng virus Care tham chiếu được lấy từ ngân hàng gene thế giới.
Kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh của các chủng virus Care nghiên cứu dựa trên sự sai khác nucleotide và axit amin ở đoạn gene P được thể hiện trong bảng 4.10, bảng 3.1, 3.2 (phụ lục 3) và hình 4.18.
Từ kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài theo sự sai khác nuclecotide gene P trong bảng 4.10 và kết quả phân tích nguồn gốc cho thấy: 3 chủng virus Care nghiên cứu nằm trong 2 nhánh phát sinh khác nhau.
Trong đó, 2 chủng virus nằm trong cùng một nhánh phát sinh thuộc genotype Asia 1 lần lượt là: CDV19-RHN và CDV28-HHN nằm trong cùng nhánh phát sinh với các chủng virus Vietnam. HCM 2014.LC 159587, Vietnam. VNUA-CDV-03 LC1139392009; Japan 2012 AB 755426; China 2012. KJ 466106; China 2010 JN896331.
+ Chủng CDV1-PHN nằm trong cùng một nhánh phát sinh với các chủng virus Thailand 2014. MH 496773 thuộc genotype Asia 1.
Như vậy dựa trên kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài theo sự sai khác nucleotide ở đoạn gen P của 3 chủng virus Care nghiên cứu, nhận thấy 3 chủng virus nghiên cứu nằm trong 2 nhánh phát sinh khác nhau, thuộc genotype Asia 1.
Kết quả nghiên cứu này có sự sai khác so với nghiên cứ của Guo et al.
(2013) đã chỉ ra virus Care gây bệnh trên gấu trúc và chó hoang thuộc genotype Classic. Bên cạnh đó, nghiên cứu của Lan et al. (2009a) đã chỉ ra chủng virus phân lập đầu tiên tại Việt Nam thuộc Genotype Asia1 cùng nhánh phát sinh với 2 chủng CDV19-RHN và CDV28-HHN trong nghiên cứu này. Điều này cho thấy có sự truyền lây bệnh giữa các vùng địa lý khác nhau trong cả nước và sự truyền lây bệnh giữa các quốc gia trên thế giới do có nhiều nguyên nhân khác nhau.
Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn chủng virus để nhập khẩu vacxin hoặc chế tạo kít chẩn đoán, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để công cường độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin., Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin trong nước từ chính các chủng virus đang lưu hành tại thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh.
Kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh của các chủng virus Care nghiên cứu dựa trên sự sai khác nucleotide và axit amin ở đoạn gene P được thể hiện tại hình 4.18.
Asia1
Hình 4.18. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene P của những chủng virus Care nghiên cứu
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1) Đã xác định được 37 chó mắc bằng phương pháp RT-PCR với các triệu chứng lâm sàng điển hình như gầy yếu, biếng ăn, ủ rũ, sốt, ho, tiêu chảy màu cà phê, nôn mửa, có dử mắt, dử mũi nhiều. Bệnh tích đại thể chủ yếu: Phổi xuất huyết, viêm ruột, xuất huyết, hạch lympho sung huyết, xuất huyết. Nghiên cứu được đặc tính sinh học của virus Care: Đã phân lập được 23 chủng virus Care trên môi trường tế bào Vero – DST. Lựa chọn được 12 chủng virus để nghiên cứu một số đặc điểm sinh học cho thấy: Bệnh tích tế bào xuất hiện đầu tiên sau 24 giờ đến 36 giờ sau khi gây nhiễm virus và tế bào Vero-DST bị phá hủy hoàn toàn sau 96 giờ. Virus Care phân lập có hiệu giá cao từ 1,44 x 102 đến 3,16x105 TCID50/ml. Trong đó 3 chủng virus Care CDV1-RHN, CDV19-PHN, CDV28- HHN nhân lên ổn định trong môi trường nuôi cấy tế bào Vero- DST cho thấy hàm lượng virus trong tế bào thường cao hơn hàm lượng virus ngoài tế bào. Hàm lượng virus đạt mức cao nhất ở 48 giờ đến 60 giờ sau gây nhiễm.
2) Nghiên cứu được đặc tính sinh học phân tử của virus Care 3 chủng virus Care CDV1-RHN, CDV19-PHN, CDV28- HHN phân lập được dựa trên kết quả giải trình tự gene P. Kết quả giải trình tự gene đoạn gene P có độ dài 387 bp Mức độ tương đồng về nucleotide và axit amin của gene P giữa 3 chủng virus nghiên cứu lần lượt đạt tỷ lệ lần lượt từ 93,00% - 99,4% và 88,01% - 98,0%. 3 chủng virus Care CDV1-RHN, CDV19-PHN, CDV28- HHN phân lập được nằm trong 2 nhánh phát sinh khác nhau và đều thuộc genotype Asia1.
5.2. KIẾN NGHỊ
1) Tiếp tục thu thập các chó mắc bệnh Care tại 5 địa phương nghiên cứu trên các giống chó khác để có thể phân lập được nhiều mẫu virus Care phục vụ cho việc sàng lọc và lựa chọn chủng virus từ thực địa.
2) Tiếp tục nghiên cứu và đánh giá về sự ổn định đặc tính sinh học của 3 chủng virus Care phân lập được trên môi trường nuôi cấy dòng tế bào Vero-DST qua nhiều đời và đánh giá độc lực trên chó thí nghiệm.
3) Tiếp tục nghiên cứu giải trình tự toàn bộ genome của 3 chủng virus Care phân lập được nhằm xác định được sự khác nhau về dữ liệu di truyền giữa các chủng virus nghiên cứu.
4) Nghiên cứu lựa chọn chủng vacxin Care thích hợp cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chẩn đoán cũng như chế tạo Kit chẩn đoán nhanh chó mắc bệnh Care.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Hồ Đình Chúc (1993). Bệnh Care trên đàn chó ở Việt Nam và kinh nghiệm điều trị, Công trình nghiên cứu, Hội thú y Việt Nam.
2. Lê Thị Tài (2006). Một số bệnh mới do virus. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương (2009). Giáo trình Miễn dịch học thú y. NXB Nông nghiệp. tr. 79 - 84.
4. Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương (2010). Giáo trình Miễn dịch học ứng dụng. NXB Nông nghiệp. tr.153 - 156.
5. Nguyễn Hữu Nam (2011). Báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp bộ, tr. 16, 30-34.
6. Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam (2012). Đặc điểm bệnh lý của chó phú quốc mắc bệnh care và ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để chẩn đoán bệnh. Tạp chí Khoa học và Phát triển. 10 (6). tr. 913-918.
7. Nguyễn Thị Lan và Trần Trung Kiên (2010). Nghiên cứu bệnh Care trên chó vùng Hà Nội bằng phương pháp giải phẫu bệnh lý và mô hóa miễn dịch. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y. XVII (2). tr. 14-18.
8. Nguyễn Thị Lan, Bounheuang Sihoungvanh, Nguyễn Thị Yến và Nguyễn Hữu Nam (2015). Một số đặc điểm bệnh lý của chó được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus Care (CDV-768). Tạp chí Khoa học và Phát triển. 13 (1). tr. 56-64. 9. Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Huyên (2012). Nghiên cứu
một số đặc điểm sinh học của virus gây bệnh Care phân lập trên đàn chó nuôi tại Hà Nội. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 19 (4). tr. 11-17.
10. Nguyễn Văn Dũng, Vũ Kim Chiến và Phạm Xuân Thảo (2018). Phân lập và xác định đặc tính di truyền của virus gây bệnh care trên chó nuôi tại thành phố Hồ Chí Minh. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y. tr. 19-24.
11. Nguyễn Văn Thanh (2007). Bài giảng Bệnh chó mèo. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 12. Tô Du và Xuân Giao (2006). Kỹ thuật nuôi chó mèo và phòng trị bệnh thường
gặp, NXB Lao động xã hội, Hà Nội.
13. Trần Thanh Phong (1996). Một số bệnh truyền nhiễm chính trên chó, Tủ sách trường Đại học Nông lâm thành phồ Hồ Chí Minh. tr. 54-68.
14. Trần Văn Nên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Văn Thanh và Lương Quốc Hưng (2017). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 15 (1). tr. 44-45. 15. Vương Đức Chất và Lê Thị Tài (2004). Bệnh chó mèo và cách phòng trị. NXB
Nông Nghiệp, Hà Nội.
II. Tài liệu tiếng Anh:
16. An D., K. Tae-Young, S. Dae-Sub, K. Bo-Kyu and P. Bong-Kyun (2008). An Immunochromatography assay for rapid antemortem diagnosis of dogs suspected to have canine distemper. Journal of Virological Methods 147. pp. 244-249. 17. Angelika K. L., D.P. Morné, L.D. Desiré, M. Emily and H.V. Estelle (2017).
Genome Sequences of Three Vaccine Strains and Two Wild-Type Canine Distemper Virus Strains from a Recent Disease Outbreak in South Africa. pp. 23-25.
18. Bell S.C., S.D. Carter and D. Bennett (1991). Canine distemper viral antigenes and antibodies in dogs with rheumatoid arthritis. Res Vet Sci.50.(1). pp.64-68. 19. Blixenkrone M., V. Svansson, P. Have, C. Orvell, M. Appel, P.I. Rode and P.
Henriksen (1993). Studies on manifestations of canine distemper virus infection in an urban dog population. Veterinary Microbiology 37. pp. 163-173.
20. Carpenter M.A., M.J. Appel, M.N. Roelke-Parker, L. Munson, H. Hofer, M. East and S.J. O'Brien (1998). Geneetic characterization of canine distemper virus in Serengeti carnivores. Vet Immunol Immunopathol. 65(2-4). pp. 259-66.
21. Diallo A. (1990). Morbillivirus gruop: geneome organisation and protiens. Veterinary Microbiology 23. pp. 155-163.
22. Griffin D.E. (2001). Measles virus. In Fields Virology, 4th edn, pp. 1401-1441. Edited by Knipe, D. M. Philadelphia, PA: Lippincott Williams and Wilkins.
23. Haas L., W. Marthens, I. Greiser-Wilke, L. Mamaev, T. Butina, D. Maack and T. Barrett (1997). Analysis of the haemagglutinin genee of current wild-type canine distemper virus isolates from Germany. Virus Research 48. pp. 165-171.
24. Haas L., H. Liermann, T.C. Harder, T. Barrett, M. Lochelt, M.V. Von, W. Baumgarner and I. Greiser-Wilke (1999). Analysis of the H genee, the central untranslated region and the proximal coding part of the F genee of dild-type and vacxin canine distemper viruses. Veterinary Microbiology 69. pp. 15-18.
25. Keawcharoen J., A.Theamboonlers, P.Jantaradsamee, A.Rungsipipat, Y. Poovorawan and K. Oraveerakul (2005). Nucleotide sequence analysis of nucleocapsid protein genee of canine distemper virus isolates in Thailand. Division of Virology, Deparment of Pathology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University,