Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Callus cà gai leo (Solanum hainanense Hance) được tạo ra từ cây cà gai leo nuôi cấy in vitro, cây cà gai leo giống từ Yên Bái được trồng tại khu nhà lưới Viện Sinh học Nông Nghiệp (khoảng 2 năm tuổi).
Mẫu sử dụng là các đoạn thân và mảnh lá (1 cm) được lấy từ cây cà gai leo nuôi cấy in vitro và cây cà gai leo trồng ngoài tự nhiên.
3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Phịng cơng nghệ Sinh học Thực vật – Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Địa điểm phân tích HTCO: Phịng thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu và phát triển Cơng nghệ Hóa sinh.
- Thời gian nghiên cứu: 1-8/2017 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Xác định mơi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo - Loại mẫu: mô thân và mô lá cây nuôi cấy in vitro 4 tuần tuổi
- Môi trường nuôi cấy nền: môi trường MS cơ bản (Đ/C)
- Các cơng thức thí nghiệm: mơi trường MS bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng với nồng độ tương ứng theo các bảng sau:
Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ α-NAA (mg/l) 1 (Đ/C) 0 0 2 0,5 0,5 3 0,5 1,0 4 0,5 1,5 5 0,5 2,0
Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ 2,4-D (mg/l) 1 (Đ/C) 0 0 2 0,5 0,5 3 0,5 1,0 4 0,5 1,5 5 0,5 2,0
Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ 2,4-D (mg/l) 1 (Đ/C) 0 0 2 0,1 0,5 3 0,1 1,0 4 0,1 1,5 5 0,1 2,0
3.2.2. Nhân sinh khối callus
- Loại mẫu:callus từ mô thân và mô lá cây nuôi cấy in vitro
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối callus
Chọn 2 môi trường tạo callus tốt nhất ở các thí nghiệm 1, 2 và 3 để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối callus ( môi trường A1 và A2).
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng nhân sinh khối callus
Công thức Chế độ chiếu sáng
A1 16 giờ sáng/8 giờ tối
A1 Không chiếu sáng
A2 16 giờ sáng/8 giờ tối
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối callus
Công thức Đèn LED
A1 Tỉ lệ B/R: 40/60
A1 Tỉ lệ B/R: 30/70
A2 Tỉ lệ B/R: 40/60
A2 Tỉ lệ B/R: 30/70
ĐC (A1/A2) Đèn huỳnh quang T8
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của acid salisylic đến nhân sinh khối callus trên 2 môi trường A1 và A2
Công thức Nồng độ acid salisylic (µM)
ĐC (A1) 0
A1 50
A1 100
A1 150
Công thức Nồng độ acid salisylic (µM)
ĐC (A2) 0
A2 50
A2 100
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của chất chiết nấm men đến nhân sinh khối callus trên 2 môi trường A1 và A2
Công thức Nồng độ Nấm men (g/l) ĐC (A1) 0 A1 1 A1 3 A1 5 Công thức Nồng độ Nấm men (g/l) ĐC (A2) 0 A2 1 A2 3 A2 5
3.2.3. Đánh giá sự tích lũy các hoạt chất thứ cấp thơng qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên
- Loại mẫu: Dịch chiết callus cà gai leo, dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên Thí nghiệm 9: Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên trên tế bào gan chuột
- Cây cà gai leo trồng ngoài tự nhiên (khoảng 2 năm tuổi) được chiết bằng dung môi cồn 700, sau đó được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua q trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột.
Công thức Nồng độ cà gai leo
(mg/100ml) 1 (Đ/C) 0 2 5 3 10 4 15 5 20 6 25
Thí nghiệm 10: Đánh giá ảnh hưởng của môi trường ni cấy đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus trên tế bào gan chuột
- Trong 2 nền môi trường A1 và A2 chọn môi trường cho khả năng nhân sinh khối tốt nhất để nhân callus và chiết trong dung môi cồn 700, sau đó được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua q trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột. CT Nồng độ callus (mg/100ml) 1 (Đ/C) 0 2 5 3 10 4 15 5 20 6 25
Thí nghiệm 11: Đánh giá ảnh hưởng của mơi trường ni cấy có bổ sung chất chiết nấm men đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus trên tế bào gan chuột
- Chọn mơi trường ni cấy có bổ sung chất chiết nấm men với nồng độ thích hợp nhất tới khả năng nhân sinh khối callus.
- Nhân callus trên môi trường trên và chiết bằng dung môi cồn 700, sau đó được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua q trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột.
Công thức Nồng độ callus (mg/100ml) 1 (Đ/C) 0 2 5 3 10 4 15 5 20 6 25
Thí nghiệm 12: Đánh giá ảnh hưởng của mơi trường ni cấy có bổ sung acid salisylic đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus trên tế bào gan chuột
- Chọn mơi trường ni cấy có bổ sung acid salisylic với nồng độ thích hợp nhất tới khả năng nhân sinh khối callus.
- Nhân callus trên môi trường trên và chiết bằng dung mơi cồn 700, sau đó được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua q trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột.
Cơng thức Nồng độ callus (mg/100ml) 1 (Đ/C) 0 2 5 3 10 4 15 5 20 6 25
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro 3.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro
- Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS
(Murahige & Skoog, 1962: 6g/l saccarose và 100 mg/l innositol), pH mơi trường 5,8; thể tích dung dịch trong mỗi bình ni cấy là 40 - 50ml.
- Mơi trường nuôi cấy hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút ở áp suất 1,0 at. - Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhân tạo, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được giữ ổn định:
+ Cường độ ánh sáng: 2500 - 2800 Lux + Thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối + Độ ẩm: 70 - 80%
+ Nhiệt độ: 25 ± 20C 3.3.2. Nuôi cấy cây in vitro
Hạt cà gai leo được rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy trong 5 phút và được làm khơ. Sau đó đưa vào box cấy vơ trùng, mẫu cho vào tráng rửa
bằng cồn 700 trong thời gian 1-2 phút. Sau đó rửa lại bằng nước cất vơ trùng 1-2 lần, mỗi lần 1 phút. Tiếp theo, mẫu được ngâm lắc trong dung dịch dung dịch NaDCC (Sodium dichloroisocyanurate) nồng độ 5g/l trong thời gian 10 phút và rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng, mỗi lần 1 phút. Mẫu sau khử trùng được cấy vào môi trường MS + 25 g/l saccarose + 4,3 g/l agar, pH= 5,8 (môi trường nền). Cuối cùng, mẫu được đưa vào ủ tối để hạt nảy mầm và để loại nhiễm.
Cây in vitro sau khi nảy mầm được cấy chuyển trên môi trường nền để
ni cây lớn. Các đoạn thân có mắt lá của cây in vitro tiếp tục được cấy trên môi trường nền để nhân cây tạo nguyên liệu.
3.3.3. Nuôi cấy callus, nhân sinh khối callus
Các bộ phận khác nhau của cây cà gai leo in vitro: cuống lá, mảnh lá, đoạn thân có kích thước khoảng 1cm được ni cấy trên mơi trường nền có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng để đánh giá khả năng cảm ứng tạo callus. Callus sau 4 tuần tuổi được cắt thành những khối nhỏ khoảng 250 mg sử dụng để nhân sinh khối callus, theo dõi ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, điều kiện chiếu sáng và các chất kích ứng đến khả năng nhân sinh khối callus.
Callus được nhân sinh khối sau 3 tuần tuổi được theo dõi các chỉ tiêu như: khối lượng tươi, khối lượng khơ, hình thái callus...
Khối lượng tươi trung bình 1 mẫu callus (mg) = Khối lượng tươi trung bình callus của 1 bình (mg) / số mẫu 1 bình (mg).
Khối lượng khơ trung bình 1 mẫu callus (mg) = Khối lượng khơ trung bình callus của 1 bình (mg) / số mẫu 1 bình (mg).
3.3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus
Callus nhân sinh khối sau 3 tuần tuổi trên môi trường A1 hoặc A2, môi trường A1 hoặc A2 có bổ sung thêm chất chiết nấm men và acid salisylic riêng rẽ ở cùng một điều kiện nuôi cấy được sấy khơ rồi chiết trong dung mơi thích hợp. 3.3.4.1 Phương pháp chiết callus cà gai leo nuôi cấy in vitro và chiết cây cà gai leo trồng ngoài tự nhiên
- Callus thu được theo từng cơng thức thí nghiệm và mơ thân, mơ lá của cây trồng tự nhiên (2 năm tuổi) được sấy khô đến khối lượng không đổi và nghiền mịn.
- Lọc lấy dịch chiết, chiết tiếp lần 2 trong dung môi cồn 700 ở 60-700C. - Dịch chiết thu được đem cô đặc ở nhiệt độ 700C trong 10 phút và cân chính xác khối lượng thu được.
- Cao cô đặc thu được lên thể tích 2 ml bằng cồn 500 , được sử dụng để pha thành các dung dịch có nồng độ khác nhau dùng trong nghiên cứu.
3.3.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus
Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thơng qua q trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của Blagodorov (1987).
-Nguyên liệu động vật: Gan tươi của chuột nhắt trắng chủng Swiss khoẻ
mạnh, nặng 22 ± 2 g.
-Hoá chất: Đệm Tris, FeSO4, axit ascorbic, TCA, axit thiobacbituric... -Tiến hành: Mổ lấy gan chuột nhắt. Cân chính xác 100mg gan chuột làm
homogennat trong cối sứ ở điều kiện 40 C với 5 ml đệm Tris 0,04 M, pH = 7,4 và 10 ml H2O. Ly tâm ở 600 vòng / phút trong 10 phút. Sau đó lấy 3 ml dịch ly tâm cho vào hỗn hợp gồm: 0,4 ml FeSO4 10-3 M; 0,4 ml dung dịch axit ascorbic 10-2 M và dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên với nồng độ tùy từng cơng thức ở mỗi thí nghiệm. Ủ hỗn hợp ở 370 C trong 1 giờ, lấy hỗn hợp ủ ra. Thêm 2 ml dung dịch axit thiobacbituric 0,25%. Đun sôi cách thuỷ khoảng 15 phút, để nguội. Đo màu ở bước sóng 532 nm.
Lượng DAM được tính theo cơng thức: C = D/ ε . l
Trong đó:
C: số mol DAM D: mật độ quang học
l: chiều dày cuvet ε: hệ số tắt mol = 1,56.10-5 M cm-1 3.3.5 Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Microsoft Excel (2003;2007 và 2010) và SAS 9.1.
Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (độ tin cậy là 95%).Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV(%).
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ 4.1 KẾT QUẢ
4.1.1. Xác định mơi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo 4.1.1.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus 4.1.1.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus
Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus đối với mẫu sử dụng là đoạn thân và mảnh lá cây cà gai leo in
vitro được thể hiện ở bẳng 4.1 và 4.2.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ đoạn thân cà gai leo
CT Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ α-NAA (mg/l)
Khối lượng tươi TB (mg/mẫu) Khối lượng khô TB (mg/mẫu) Hình thái callus 1 /ĐC (MS) 0 0 0,00 d 0,00e - 2 0,5 0,5 214,00c 16,72b + 3 1,0 345,65a 21,15a ++ 4 1,5 254,47b 12,26 c + 5 2,0 224,40c 10,05d + CV% 4,63 5,84
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có nghĩa thống kê của các trung bình mẫu ở p < 0,05 (Duncan's test).
(-) không tạo callus; (+) callus tạo được ít ; (++) callus tạo được vừa, vàng nhạt, xốp ; (+++) callus tạo được nhiều, vàng nhạt, xốp
Hình 4.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ đoạn thân cà gai leo
CT2: 0,5mg/l BA +0,5 mg/l α-NAA; CT3: 0,5 mg/l BA + 1 mg/l α-NAA; CT4: 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l α-NAA; CT5: 0,5 mg/l BA + 2 mg/l α-NAA
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ mảnh lá cà gai leo
CT Nồng độ BA (mg/l) NAA (mg/l) Nồng độ α- Khối lượng tươi TB (mg/mẫu) Khốilượng khô TB (mg/mẫu) Hình thái callus 1 Đ/C (MS) 0 0 0,00 e 0,00e - 2 0,5 0,5 374,24d 31,34d + 3 1,0 463,36c 44,68c + 4 1,5 826,69a 70,70a ++ 5 2,0 650,77b 58,02b ++ CV% 2.03 5.78
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có nghĩa thống kê của các trung bình mẫu ở p < 0,05 (Duncan's test)
(-) không tạo callus; (+) callus tạo được ít ; (++) callus tạo được vừa, xanh nhạt, rắn ; (+++) callus tạo được nhiều, xanh nhạt, rắn
Hình 4.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ mảnh lá cà gai leo
CT2: 0,5mg/l BA +0,5 mg/l α-NAA; CT3: 0,5 mg/l BA + 1 mg/l α-NAA; CT4: 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l α-NAA;
CT5: 0,5 mg/l BA + 2 mg/l α-NAA
Callus sau 4 tuần tuổi được tạo ra từ đoạn thân có màu vàng nhạt, tương đối xốp và rời rạc trong khi callus có nguồn gốc từ mảnh lá có màu trắng xốp ở phía trên, xanh nhạt ở phía dưới, một số xù lên thành khối lớn màu xanh, rắn. Callus được tạo ra từ mảnh lá rắn hơn so với callus có nguồn gốc từ đoạn thân.
Trên môi trường MS cơ bản các đoạn thân và mảnh lá đều không tạo callus. Khi bổ sung 0,5 mg/l BA và α-NAA có nồng độ từ 0,5-2,0 mg/l callus hình thành. Callus nguồn gốc từ mơ thân ở CT3 (MS + 0,5 mg/l BA + 1 mg/l α- NAA) có khối lượng tươi và khô cao nhất lần lượt là 345,65 mg và 21,15 mg (bảng 4.1). Khi tăng nồng độ α-NAA lên 2 mg/l khối lượng tươi và khô giảm xuống còn 224,4 mg khối lượng tươi và 10,05 mg khối lượng khô.
Callus nguồn gốc từ mơ lá có khối lượng tươi và khơ tăng dần khi bổ sung α-NAA với nồng độ từ 0,5-1,5mg/l và bắt đầu giảm ở nồng độ 2mg/l. Callus ở CT4 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l α-NAA) có khối lượng tươi và khơ cao nhất lần lượt là 826,69 mg và 70,7 mg (bảng 4.2). Khi tăng nồng độ α-NAA lên 2 mg/l khối lượng tươi và khơ giảm xuống cịn 650,77 mg khối lượng tươi và 58,02 khối lượng khô.
Như vậy bổ sung BA và α-NAA với nồng độ thích hợp giúp tăng khối lượng tươi và khơ callus tạo thành, tuy nhiên lượng callus tạo ra còn chưa được nhiều. 4.1.1.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus
Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus đối với mẫu sử dụng là đoạn thân và mảnh lá cây cà gai leo in
vitro được thể hiện ở bẳng 4.3 và 4.4
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn thân cà gai leo
CT Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ 2,4-D (mg/l) Khối lượng tươi TB (mg/mẫu) Khốilượng khô TB (mg/mẫu) Hình thái callus 1 Đ/C (MS) 0 0 0,00e 0,00e - 2 0,5 0,5 425,00c 21,62c ++ 3 1,0 458,86b 25,00b ++ 4 1,5 508,93a 26,70a +++ 5 2,0 246,71d 15,60d + CV% 3,60 4.73
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có nghĩa thống kê của các trung bình mẫu ở p < 0,05 (Duncan's test)
(-) không tạo callus; (+) callus tạo được ít ; (++) callus tạo được vừa, vàng nhạt, xốp ; (+++) callus tạo được nhiều, vàng nhạt, xốp
Hình 4.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn thân cà gai leo
CT2: 0,5mg/l BA +0,5 mg/l 2,4-D; CT3: 0,5 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D; CT4: 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D; CT5:
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh lá cà gai leo
CT BA (mg/l) Nồng độ 2,4-D (mg/l) Nồng độ Khối lượng tươi TB (mg/mẫu) Khốilượng khơ TB (mg/mẫu) Hình thái callus 1 Đ/C (MS) 0 0 0,00e 0,00e - 2 0,5 0,5 696,07c 47,02c ++