Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro
- Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS
(Murahige & Skoog, 1962: 6g/l saccarose và 100 mg/l innositol), pH môi trường 5,8; thể tích dung dịch trong mỗi bình ni cấy là 40 - 50ml.
- Môi trường nuôi cấy hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút ở áp suất 1,0 at. - Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhân tạo, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được giữ ổn định:
+ Cường độ ánh sáng: 2500 - 2800 Lux + Thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối + Độ ẩm: 70 - 80%
+ Nhiệt độ: 25 ± 20C 3.3.2. Nuôi cấy cây in vitro
Hạt cà gai leo được rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy trong 5 phút và được làm khơ. Sau đó đưa vào box cấy vơ trùng, mẫu cho vào tráng rửa
bằng cồn 700 trong thời gian 1-2 phút. Sau đó rửa lại bằng nước cất vơ trùng 1-2 lần, mỗi lần 1 phút. Tiếp theo, mẫu được ngâm lắc trong dung dịch dung dịch NaDCC (Sodium dichloroisocyanurate) nồng độ 5g/l trong thời gian 10 phút và rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng, mỗi lần 1 phút. Mẫu sau khử trùng được cấy vào môi trường MS + 25 g/l saccarose + 4,3 g/l agar, pH= 5,8 (môi trường nền). Cuối cùng, mẫu được đưa vào ủ tối để hạt nảy mầm và để loại nhiễm.
Cây in vitro sau khi nảy mầm được cấy chuyển trên môi trường nền để
nuôi cây lớn. Các đoạn thân có mắt lá của cây in vitro tiếp tục được cấy trên môi trường nền để nhân cây tạo nguyên liệu.
3.3.3. Nuôi cấy callus, nhân sinh khối callus
Các bộ phận khác nhau của cây cà gai leo in vitro: cuống lá, mảnh lá, đoạn thân có kích thước khoảng 1cm được ni cấy trên mơi trường nền có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng để đánh giá khả năng cảm ứng tạo callus. Callus sau 4 tuần tuổi được cắt thành những khối nhỏ khoảng 250 mg sử dụng để nhân sinh khối callus, theo dõi ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, điều kiện chiếu sáng và các chất kích ứng đến khả năng nhân sinh khối callus.
Callus được nhân sinh khối sau 3 tuần tuổi được theo dõi các chỉ tiêu như: khối lượng tươi, khối lượng khơ, hình thái callus...
Khối lượng tươi trung bình 1 mẫu callus (mg) = Khối lượng tươi trung bình callus của 1 bình (mg) / số mẫu 1 bình (mg).
Khối lượng khơ trung bình 1 mẫu callus (mg) = Khối lượng khô trung bình callus của 1 bình (mg) / số mẫu 1 bình (mg).
3.3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus
Callus nhân sinh khối sau 3 tuần tuổi trên môi trường A1 hoặc A2, mơi trường A1 hoặc A2 có bổ sung thêm chất chiết nấm men và acid salisylic riêng rẽ ở cùng một điều kiện nuôi cấy được sấy khơ rồi chiết trong dung mơi thích hợp. 3.3.4.1 Phương pháp chiết callus cà gai leo nuôi cấy in vitro và chiết cây cà gai leo trồng ngoài tự nhiên
- Callus thu được theo từng cơng thức thí nghiệm và mơ thân, mơ lá của cây trồng tự nhiên (2 năm tuổi) được sấy khô đến khối lượng không đổi và nghiền mịn.
- Lọc lấy dịch chiết, chiết tiếp lần 2 trong dung môi cồn 700 ở 60-700C. - Dịch chiết thu được đem cô đặc ở nhiệt độ 700C trong 10 phút và cân chính xác khối lượng thu được.
- Cao cơ đặc thu được lên thể tích 2 ml bằng cồn 500 , được sử dụng để pha thành các dung dịch có nồng độ khác nhau dùng trong nghiên cứu.
3.3.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus
Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thơng qua q trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của Blagodorov (1987).
-Nguyên liệu động vật: Gan tươi của chuột nhắt trắng chủng Swiss khoẻ
mạnh, nặng 22 ± 2 g.
-Hoá chất: Đệm Tris, FeSO4, axit ascorbic, TCA, axit thiobacbituric... -Tiến hành: Mổ lấy gan chuột nhắt. Cân chính xác 100mg gan chuột làm
homogennat trong cối sứ ở điều kiện 40 C với 5 ml đệm Tris 0,04 M, pH = 7,4 và 10 ml H2O. Ly tâm ở 600 vòng / phút trong 10 phút. Sau đó lấy 3 ml dịch ly tâm cho vào hỗn hợp gồm: 0,4 ml FeSO4 10-3 M; 0,4 ml dung dịch axit ascorbic 10-2 M và dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên với nồng độ tùy từng công thức ở mỗi thí nghiệm. Ủ hỗn hợp ở 370 C trong 1 giờ, lấy hỗn hợp ủ ra. Thêm 2 ml dung dịch axit thiobacbituric 0,25%. Đun sôi cách thuỷ khoảng 15 phút, để nguội. Đo màu ở bước sóng 532 nm.
Lượng DAM được tính theo cơng thức: C = D/ ε . l
Trong đó:
C: số mol DAM D: mật độ quang học
l: chiều dày cuvet ε: hệ số tắt mol = 1,56.10-5 M cm-1 3.3.5 Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Microsoft Excel (2003;2007 và 2010) và SAS 9.1.
Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (độ tin cậy là 95%).Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV(%).