2,4-D thường kết hợp với cytokinin để cảm ứng tạo mô sẹo và huyền phù tế bào. Nồng độ cao 2,4-D kết hợp với nồng độ thấp BA giúp cảm ứng tạo callus tốt hơn. Kết hợp giữa tổ hợp 2,4-D và BA với tỉ lệ thích hợp giúp cảm ứng tạo callus cà gai leo tốt hơn so với tổ hợp α-NAA. Sinh khối tươi và khô callus nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l và 1mg/l 2,4-D thu được cao nhất. 2,4-
D kích thích sự phân chia tế bào nhanh nhưng lại phá hủy cấu trúc chặt chẽ của tế bào làm cho tế bào xốp. Cytokinin cần thiết cho sự hình thành các hợp chất thứ cấp, khi kết hợp BA với 2,4-D giúp cảm ứng tạo callus và tạo các hợp chất thứ cấp. Hai môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) và môi trường A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) đều cho sinh khối tươi và khô cao. Callus có nguồn gốc từ đoạn thân có màu vàng nhạt, xốp và rời rạc, thích hợp để nhân sinh khối callus. Trên nền môi trường A1 sinh khối tươi và khô lần lượt là 508,93 mg và 26,7 mg, còn trên môi trường A2 sinh khối tươi và khô đạt 636,72 mg và 27,84 mg. Kết quả của chúng tôi cũng tương tự như nghiên cứu của Võ Châu Tuấn và cs. (2014) khi nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen nhận thấy tế bào sinh trưởng tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L 2,4- D và 0,5 mg/L BA. 4.2.2. Nhân sinh khối callus
4.2.2.1. Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng
Ở điều kiện chiếu sáng:18h chiếu sáng/6h tối môi trường A2 cho sinh khối tươi và khô cao hơn so với nuôi cấy nhân sinh khối trên môi trường A1. Sinh khối tươi và khô của callus có nguồn gốc từ đoạn thân cao hơn so với callus có nguồn gốc từ mảnh lá. Sinh khối tươi và khô callus có nguồn gốc từ đoạn thân nuôi cấy trên môi trường A2 đạt 894,4 mg và 40mg. So với sinh khối tươi lúc bắt đầu nuôi cấy sinh khối tươi thu được cao gấp 3,2 lần.
Cho đến nay, đèn huỳnh quang là nguồn chiếu sáng được sử dụng phổ biến trong nhân giống thực vật. Ánh sáng huỳnh quang là sự phối trộn của nhiều vùng quang phổ có bước sóng từ 320nm đến 800nm, trong đó có những vùng bước sóng ngắn không có lợi cho sự sinh trưởng của thực vật. Trong khi đó cây chỉ hấp thụ được ánh sáng dùng cho quang hợp qua sắc tố diệp lục ở hai vùng chủ yếu là vùng ánh sáng xanh lơ (blue có bước sóng ~ 430nm) và vùng ánh sáng đỏ (có bước sóng ~ 660nm). Việc chế tạo đèn phát ra những tia sáng phù hợp với phổ hấp thụ của diệp lục sẽ nâng cao hiệu quả sử dụng ánh sáng của cây và làm giảm năng lượng chi phí của năng lượng phát ra ngoài bước sóng mà cây cần. Các nhà nghiên cứu khoa học của Rạng Đông đã nghiên cứu các phổ chiếu sáng của nhiều loại đèn khác nhau qua đó đã phát hiện: đèn huỳnh quang thường sử dụng trong các phòng nuôi cấy mô chỉ phù hợp cho mục đích chiếu sáng thông thường (theo mắt người có bước sóng tập trung trong khoảng 500-600nm), trong khi vùng ánh sáng đỏ (~660nm) là vùng diệp lục hấp thụ dùng cho quang hợp thì hầu như bị thiếu. Đèn compact cũng thiếu vùng ánh sáng đỏ cho cây, đèn thủy
ngân có ánh sáng đỏ nhưng hiệu suất thấp, đèn natri lại thiếu vùng ánh sáng xanh. Cũng phải nói thêm, ánh sáng đỏ có hiệu quả quang hợp rất cao. Ở cùng một cường độ chiếu sáng, nếu là ánh sáng đỏ thì hiệu quả quang hợp có thể tăng gấp đôi so với ánh sáng xanh (blue). Vì vậy, việc phát triển hệ thống chiếu sáng mới đang được quan tâm trong vi nhân giống thực vật. Trong đó, nguồn chiếu sáng đơn sắc (LED-Light emitting diodes) đang rất được chú trọng. So với đèn huỳnh quang thì đèn LED có nhiều ưu điểm vượt trội như: kích thước và thể tích nhỏ, tuổi thọ cao và vùng quang phổ được kiểm soát. Với những ưu điểm trên, đèn LED có thể được sử dụng thay thế dần cho đèn huỳnh quang như nguồn chiếu sáng trong nuôi cấy mô thực vật (Nhut et al., 2015).
Ánh sáng đèn LED có ảnh hưởng đến sinh trưởng tế bào ở callus. Trên môi trường nuôi cấy A1 sinh khối tươi và khô thu được cao nhất khi sư dụng ánh sáng đèn LED có tỉ lện blue/red là: 40/60, đạt 982,83 mg và 69,52 mg. Tỉ lệ ánh sáng red cao hơn ánh sáng blue giúp tăng sinh trưởng tế tào ở callus cà gai leo. Một số nghiên cứu sử dụng ánh sáng đèn LED kích thích sinh trưởng cây nuôi cấy mô cho kết quả tương tự. Nhut et al. (2015) nghiên cứu hệ thống chiếu sáng đơn sắc - nguồn sáng nhân tạo cho nghiên cứu tái sinh và nhân giống một số loại cây trồng nuôi cấy in vitro cho kết quả cây Torenia, đồng tiền, dâu tây, lan Hồ Điệp, sâm Ngọc linh sinh trưởng và phát triển tốt dưới điều kiện chiếu sáng 70% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 30% ánh sáng LED xanh, trong khi đó, cây Cúc lại phù hợp với tỷ lệ 90% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 10% ánh sáng LED xanh và cây Dâu tây dưới điều kiện chiếu sáng 70% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 30% ánh sáng LED xanh đã làm cho chúng tăng trưởng tốt ở giai đoạn vườn ươm. 4.2.2.2. Ảnh hưởng của các chất kích ứng (elicitor)
a. Ảnh hưởng của acid salisylic
Acid salisylic là một hợp chất tín hiệu thực vật quan trọng trong việc kích hoạt các gen liên quan đến cơ chế bảo vệ. Khi sử dụng làm elicitor, acid salisylic ảnh hưởng đến khả năng tích lũy các hợp chất liên quan đến cơ chế bảo vệ. acid salisylic được biết như là tác nhân chống chịu tương tác thực vật gây bệnh, nhưng không phải là chất cảm ứng vạn năng trong sản xuất các chất chuyển hóa bảo vệ thực vật (Bulgakov et al., 2002). Theo Taguchi et al. (2001), acid salysilic tích lũy ở các vị trí mầm bệnh để tấn công và kích thích hệ thống bảo vệ thực vật và việc sản xuất các HCTC.
Kết quả của chúng tôi cho thấy môi trường A2 có bổ sung 100 µM acid salisylic cho sinh khối callus tươi và khô cao nhất đạt 841.36 mg sinh khối tươi và 59,53 mg sinh khối khô. Sinh khối tươi cao gấp 3,3 lần so với lúc bắt đầu nuôi cấy. So với đối chứng là callus nuôi cấy trên môi trường A2 không bổ sung acid salisylic thì sinh khối tươi cao gấp 1,3 lần, sinh khối khô cao gấp 2,44 lần. Kết quả này tương tự như nghiên cứu của Sudha et al. (2003), xử lý 200 µM acid salisylic sau 15 ngày nuôi cấy, sinh khối tế bào Capsicum frutescens cao hơn khoảng 1,5 lần so với đối chứng không cảm ứng.
b. Ảnh hưởng của chất chiết nấm men
Dịch chiết nấm men (YE) là một elicitor sinh học, được sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật để tăng khả năng kích thích bộ máy bảo vệ, từ đó gia tăng sản xuất các HCTC (Hamza, 2013). Pitta-Alvarez et al. (2000) nghiên cứu sử dụng 0,8 mg/mL YE trên rễ tơ cây Brugmansia candida, sau 48 giờ nuôi cấy các tác giả nhận thấy hàm lượng scopolamine và hyoscyamine tăng khoảng 200% so với đối chứng (không có YE). Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy scopolamine cao hơn khoảng 600% so với đối chứng sau 24 giờ nuôi cấy. Điều này có thể được lý giải bởi trong thành phần của YE được cho là có chứa một số cation như Zn2+, Ca2+ và Co2+ có vai trò như là các elicitor phi sinh học. Bên cạnh đó YE cũng là một hợp chất bao gồm nhiều thành phần khác nhau, ngoài các amino acid, vitamin và khoáng chất, nó còn có thể chứa các thành phần elicitor khác chưa được xác nhận.
Nhân sinh khối callus trên 2 nền môi trường A1 và A2 bổ sung thêm 3 g/l chất chiết nấm men đều thu được sinh khối callus tươi và khô cao. Trên môi trường A1 + 3 g/l chất chiết nấm men sinh khối tươi đạt 1371,35 mg cao gấp 2,13 lần so với đối chứng không bổ sung chất chiết nấm men, sinh khối khô 77,84 mg cao gấp 3,35 lần so với đối chứng. Nấm men có tác dụng kích thích sinh trưởng tế bào mạnh hơn so với acid salisylic. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự như kết quả nghiên cứu của Jain et al. (2015) trên một đối tượng khác của họ cà
là Solanum melongena. Khi xử lý 3 g/L YE trên rễ tơ cây Solanum melongena,
sinh khối thu được cao hơn đối chứng khoảng 2 lần sau 28 ngày.
4.2.3. Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus sinh học dịch chiết callus
kích thích sinh trưởng tế bào mạnh, sinh khối tươi và khô đều tăng so với đối chứng không bổ sung. Tuy nhiên để đánh giá trong callus thu được có sự tích lũy các hợp chất thứ cấp hay không, đặc biệt là các chất có tác dụng bảo vệ gan mà trong cà gai leo chứa nhiều như solasodine cần có thử nghiệm để đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết callus. Chúng tôi xác định hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết callus thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của Blagodorov (1987).
Các kết quả thí nghiệm cho thấy ở nồng độ dịch chiết 20 mg/100 ml, HTCO của dịch chiết callus và dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên đều cao nhất và giảm khi tăng nồng độ dịch chiết lên 25mg/100 ml. Dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi trường A2 cao gấp 1,83 lần so với dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên. Bổ sung elicitor vào môi trường A2 đê nhân sinh khối cũng làm tăng HTCO của dịch chiết callus, HTCO tăng gấp 2,31 lần khi bổ sung 100 µM acid salisylic và tăng gấp 2,73 lần khi bổ sung 3 g/l chất chiết nấm men so với dịch chiết của cây cà gai leo tự nhiên. Bổ sung các elicitor vào môi trường nuôi cấy đã ảnh hưởng đến sinh trưởng tế bào và sự tích lũy các HCTC của tế bào.
Kết quả của chúng tôi cho thấy trong callus cà gai leo thu được khi nhân sinh khối trên môi trường A2 và môi trường A2 có bổ sung thêm các elicitor đều có sự tích lũy của các HCTC có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các HCTC có hoạt tính chống oxy hóa. Ở nồng độ elicitor thích hợp, sinh trưởng tế bào ở callus cà gai leo mạnh nhất, sự tích lũy HCTC cũng nhiều hơn. Có thể nhận thấy điều này do HTCO của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi trường bổ sung các elicitor đều tăng so với dịch chiết callus được nhân sinh khối trên môi trường không có elicitor.
Như vậy với những ưu việt của công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật như hệ số nhân nhanh, sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền..., nuôi cấy tạo callus, nhân sinh khối callus hoàn toàn có thể thay thế cây trồng tự nhiên để làm nguồn nguyên liệu dồi dào cho sản xuất dược phẩm chữa bệnh, đem lại lợi ích kinh tế cao.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN
1. Cảm ứng tạo callus
Bổ sung tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng BA + α-NAA và BA + 2,4-D vào môi trường MS đã cảm ứng được sự tạo callus từ mô lá và mô thân cây cà gai leo in vitro. Môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) và A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) là thích hợp để cảm ứng tạo callus.
2. Nhân sinh khối callus
Khi chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang, môi trường nuôi cấy A2 ưu thế hơn khi nhân sinh khối callus mô thân và mô lá so với môi trường A1.Chế độ chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối thích hợp để nhân nhanh callus hơn chế độ không chiếu sáng. Dưới điều kiện chiếu sáng đèn LED, tỉ lệ B/R: 30/70 thích hợp nhất với nhân callus nguồn gốc từ mảnh lá trên môi trường A2. Đối với callus nguồn gốc từ đoạn thân tỉ lệ B/R : 40/60 thích hợp hơn để nhân callus trên môi trường A1. Môi trường A1 và A2 bổ sung 100 µM acid salisylic; môi trường A1 và A2 bổ sung 3 g/l chất chiết nấm men kích thích sự tăng trưởng khối lượng khô trung bình callus từ 1,81 đến 3,35 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor.
3. Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua hoạt tính sinh học dịch chiết callus
Nồng độ 20 mg/100 ml dịch chiết callus có hiệu quả chống oxy hóa cao nhất so với các nồng độ thử nghiệm khác. Ở nồng độ này HTCO của dịch chiết callus cao gấp 1,83 lần so với dịch chiết của cây trồng tự nhiên. Bổ sung elicitor (nấm men và acid salisylic) vào môi trường nuôi cấy làm tăng hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus từ 1,26-1,49 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor; tăng từ 2,31-2,73 lần so với dịch chiết cây tự nhiên.
5.2. ĐỀ NGHỊ
1. Sử dụng những kết quả nghiên cứu nêu trên trong sản xuất sinh khối callus cà gai leo.
2. Nghiên cứu nhân sinh khối tế bào cà lai leo trên môi trường lỏng lắc, trên các hệ lên men bioreactor.
3. Nghiên cứu tách chiết các hợp chất thứ cấp có trong callus cà gai leo để đánh giá chính xác hơn tác động của elicitor đến sự tích lũy các hợp chất này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt:
1. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006). Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn (Catharanthus roseus). Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ.(9). tr. 59-66. 2. Đào Thị Kim Nhung, Đổ Thị Gấm, Đào Thị Hoa, Trần Nam Thái (2006). Khảo
sát một số đặc điểm hoá học và tác dụng chống oxy hoá - antioxydant của các hợp chất Flavonoid chiết xuất từ lá cây vải và cây nhãn họ bồ hòn Sapindaceae. Tuyển tập các báo cáo của Hội nghị hoá sinh y dược. tr. 205-214.
3. Đỗ Trung Đàm (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược. Nhà xuất bản KH & KT, Hà nội. tr. 171-184.
4. Lê Thị Hà Thanh, Đoàn Hữu Nhật Bình, Nguyễn Hoàng Lộc (2009). Sản xuất glycoalkaloid từ tế bào cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance). Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. tr. 697-700. 5. Lê Thị Thủy Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn Đức Lượng, (2010). Khảo sát vài
yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp taxol của các hệ thống tế bào Taxus wallichiana Zucc. in vitro. Tạp chí phát triển KH&CN. 13 (T3-2010). tr. 67-75. 6. Nguyễn Bích Thu, Nguyễn Minh Khai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu (2000).
Nghiên cứu tác dụng của cà gai leo (Solanum hainanense Hance) trên collagenase. Tạp chí Dược liệu. 05 (05). tr. 149-152.
7. Nguyễn Hữu Thuần Anh (2016). Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor đến khả năng tích lũy solasodine trên tế bào in vitro của cây cà gai leo. Luận văn Thạc sỹ. Đại học Huế. tr. 41-66.
8. Nguyễn Ngọc Hồng, Võ Văn Giàu, Huỳnh Ngọc Thụy, Trần Hùng, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2010). Nghiên cứu và thử nghiệm hoạt tính bảo vệ tế bào gan ex vivo
của cao chiết cây râu mèo. Tạp chí phát triển KH&CN. 13 (T3-2010). tr. 58-65. 9. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Văn Minh,
NguyễnThị Phương Thảo (2009). Cơ sở công nghệ sinh học Công nghệ sinh học tế bào. Tập 3, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.
10. Nguyễn Quang Trường (1995). Các phương pháp xác định và một số xu hướng nghiên cứu thuốc gắn với quá trình peroxy hóa. Tạp chí dược học. 03. tr. 23 -26.
11. Nguyễn Thị Minh Khai, Phạm Kim Mãn, Nguyễn Bích Thu, Vũ Kim Thu, Phạm Thanh Trúc, Lã Kim Oanh, Nguyễn Văn Mùi, Trịnh Thị Xuân Hòa, Nguyễn Anh Tuấn, Mão NĐ (2001). Nghiên cứu điều chế thuốc Haina điều trị viêm gan B mạn hoạt động từ cà gai leo. Tạp chí Dược liệu. 6 (02). tr. 68-71.
12. Phạm Kim Mãn, Nguyễn Bích Thu, Trần Văn Hanh (1999). Tác dụng chống ung thư của cà gai leo. Thông báo Tạp chí Dược liệu. 03 (04). tr. 126.
13. Phạm Thị Tố Liên, Võ Thị Bạch Mai (2007). Bước đầu nghiên cứu sự tạo dịch treo tế bào cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa Harms). Tạp chí phát triển KH &CN. 10 (07). tr. 11-16.