Hiện tượng kháng thuốc phát sinh do tiếp xúc nhiều lần với các thuốc hóa học trị liệu hoặc truyền từ vi khuẩn đề kháng sang vi khuẩn mẫn cảm.
Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn được chia thành hai loại: 2.6.1. Kháng thuốc tự nhiên
Bản thân vi khuẩn bình thường đã có men hay một chất nào đó có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh, hoặc vi khuẩn đó không có vị trí công kích điểm tác động của chất kháng sinh.
2.6.2.Kháng thuốc thu được
Vi khuẩn thu được những yếu tố kháng thuốc trong quá trình sống do sự đột biến ngẫu nhiên, hoặc do tiếp xúc. Khi có được các yếu tố kháng thuốc- plasmid –factor R, hay episome, nó có khả năng truyền ngang các yếu tố kháng này giữa các chủng cùng loài và giữa các loài với nhau.
2.6.3. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn
Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn hình thành rấtt nhanh. Trước đây, cơ chế hình thánh khả năng kháng thuốc được giải thích bằng sự gia tăng biểu hiện của gen kháng thuốc. do chuyền dọc. Trong thực tế khả năng kháng thuốc cũng được truyển ngang, các gen kháng thuốc được truyền giữa các vi khuẩn với nhau trong cùng một thế hệ, hoặc giữa những loài vi khuẩn khác họ với nhau.
Có 3 phương thức truyền gen kháng thuốc theo chiều ngang:
- Sự biến nạp (transformation): một đoạn DNA trần từ tế bào cho được một tế bào khác nhận.
- Tải nạp (transduction): sự truyền một đoạn DNA từ tế bào cho sang tế bào nhận thông qua một thể thực khuẩn (bacteriophage).
- Sự tiến hợp (conjugation): sự truyền một đoạn DNA từ tế bào này sang tế bào khác, do có sự liên kết với nhau giống như sự giao phối của hai tế bào. Trong 3 phương thức truyền trên, phương thức tiếp hợp là quá trình quan trọng nhất.
2.6.4. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli
Sử dụng kháng sinh đã được coi là một trong các biện pháp hữu hiệu nhất trong phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trong chăn nuôi. Chính quá trình này đã làm xuất hiện và lan tràn các chủng vi khuẩn kháng thuốc.
Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn E.coli nói riêng tăng nhanh, lan rộng mạnh được nhiều nghiên cứu chứng minh là do các gene mã hóa nằm trên các plasmid R hoặc các transposon. Các yếu tố đó có thể di truyền dọc, di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp (Falkow, 1975). Vì vậy, ngày nay việc nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn không đơn thuần là việc sử dụng kháng sinh mẫm cảm để điều trị bệnh cho E.coli gây ra mà là nghiên cứu yếu tố gây bệnh của vi khuẩn.
Bass et al. (1999) cho thấy intergron với tỷ lệ cao nằm trên các transposon Tn21 mã hóa cho việc kháng đồng thời với nhiều loại kháng sinh trong số các chủng E.coli phân lập từ gà. Các nhà nghiên cứu cũng phát hiện thấy sự lan tràn các Tn21 trong số các chủng E.coli có độc lực nguồn gốc từ gia cầm, Tn21 có thể truyền tính kháng thuốc giữa các chủng ở người và gia cầm.
Việc tăng ngày càng nhanh các chủng vi khuẩn E.coli kháng với các loại kháng sinh đang được sử dụng rộng rãi ở người, động vật như các nhóm β-lactamin, fluroquinolons và các cephalosporins đang là mối quan tâm trên toàn cầu.
Theo Tô Liên Thu và cs. (2004), các chủng vi khuẩn E.coli phân lập được từ thịt gà kháng lại các loại kháng sinh thông thường như Streptomycin, Ampicoli, Tetracyclin, Chloramphenicol với tỷ lệ cao. Các chủng phân lập được từ thịt lợn có tỷ lệ đề kháng với các loại kháng sinh thấp hơn so với vi khuẩn phân lập được từ thịt gà. Nhiều chủng E.coli có đặc tính đa kháng, có những chủng kháng lại 8 loại kháng sinh.
Theo một nghiên cứu của Trương Hà Thái (2009), 84% các chủng E.coli
mẫn cảm với Enrofloxacin, 82% mẫn cảm với Colistin, 70% mẫn cảm với Norfloxacin. Các loại kháng sinh còn lại bị các chủng E.coli kiểm tra kháng với tỷ lệ cao.
Theo Nguyễn Thị Liên Hương (2009), kết quả xác định khả năng mẫn cảm của kháng sinh cho thấy duy nhất Ceftriaxon còn có khả năng mẫn cảm mạnh (100%) với các chủng kiểm tra. Các kháng sinh có tỷ lệ kháng cao (>80%) là Tetraxyclin, Sunfamethoxazol/Trimethoprim, Apramycin, Ceftiofur và Streptomycin. Hai loại kháng sinh là Spectinomycin và Gentamycin vẫn có thể dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do E.coli gây ra ở ngan.
Võ Thành Thìn (2011) phân tích gen kháng kháng sinh của 184 chủng vi khuẩn E.coli phân lập từ lợn con mắc bệnh tiêu chảy tại một số tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên cho thấy tất cả các chủng đều mang ít nhất một chủng kháng kháng sinh. Trong đó, tỷ lệ các chủng vi khuẩn mang một gen đề kháng nhóm kháng sinh Aminoglycosid là cao nhất (98,37%), tiếp theo là nhóm Tetracylin (95,11%), Sulfonamid (84,24%), β-lactam (62,5%), Phenicol (56,52%) và Quinolone (46,74%).
Bùi Thị Ba (2012) phân tích gen kháng kháng sinh của 34 chủng vi khuẩn
E.coli O157:H7 phân lập từ trâu bò khỏe mạnh tại một số tỉnh Nam Trung Bộ thấy rằng tất cả các chủng vi khuẩn đều mang ít nhất một gen kháng kháng sinh. Trong đó, tỷ lệ các chủng mang gen kháng với nhóm Sulfonamid là cao nhất (67,65%), tiếp theo là nhóm β-lactam (64,7%), Aminoglycoside (55,88%), Tetracycline và phenicol cùng chiếm (38,24%) và Quinolone (32,35%).
2.7. ĐẶC ĐIỂM CỦA VỊT BIỂN 15 – ĐẠI XUYÊN
Giống vịt Biển 15 - Đại Xuyên được nghiên cứu và khảo nghiệm từ năm 2012 và được Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.công nhận giống vật nuôi được phép sản xuất kinh doanh tại Việt Nam vào năm 2014. Đây là giống vịt kiêm dụng, năng suất trứng cao (235 – 240 quả/mái/năm) đến nay giống vịt biển 15 - Đại Xuyên đã được nuôi giữ tại nhiều địa phương trong cả nước, từ Quảng Ninh, Hải Phòng, Ninh Bình, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Thuận, Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang,…
Việt Nam là quốc gia có 3260 km bờ biển, với nguồn thủy sinh phong phú nhưng chưa có giống vịt nào có khả năng chịu mặn, thích hợp với môi trường chăn nuôi ven biển. Giống vịt biển 15 có khả năng thích nghi rộng trên mọi loại nước, sinh trưởng nhanh, chất lượng thịt, trứng cao nên vịt Biển 15 - Đại Xuyên được một số hộ nuôi thủy cầm lựa chọn. Giống vịt Biển 15 - Đại Xuyên là giống vịt kiêm dụng có chất lượng thịt cao, có thể nuôi theo nhiều phương thức khác nhau. Vịt có khả năng thích nghi và sản xuất tốt trong điều kiện chăn nuôi và khí hậu của nước ta, có thể sử dụng thức ăn là các phụ phẩm nông nghiệp, thích hợp phương thức nuôi công nghiệp, bán công nghiệp, tận dụng đều mang lại hiệu quả cao. Đặc biệt là giống vịt này có khả năng tự kiếm mồi rất tốt cả ở nước mặn và nước lợ, có khả năng chịu đựng cao. Sản phẩm thịt phù hợp thị yếu người tiêu dùng trong nước. Các nghiên cứu cho thấy có thể nuôi vị biển ở những vùng bị xâm nhập mặn và tại các đảo xa đất liền.
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Vịt Biển 15 – Đại Xuyên hậu bị và vịt đẻ được nuôi trong môi trường nước ngọt và môi trường nước mặn.
- Các chủng vi khuẩn E.coli phân lập được từ vịt Biển 15 – Đại Xuyên nuôi ở 2 môi trường nước ngọt và nước mặn.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn E.coli từ mẫu phân của vịt Biển 15 - Đại Xuyên thuộc hai nhóm hậu bị và sinh sản.
- Xác định ảnh hưởng của môi trường nước (nước ngọt và nước mặn) đến tỷ lệ phân lập E. coli từ vịt biển 15.
- Đánh giá tính mẫn cảm của các chủng E. coli phân lập với 14 loại kháng sinh.
- Xác định các triệu chứng và bệnh tích liên quan đến E. coli trên vịt Biển 15 Đại Xuyên.
- Đánh giá kết quả phòng và trị bệnh do E. coli của quy trình đang được áp dụng tại cơ sở nghiên cứu.
3.3. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.3.1. Động vật và nguyên liệu cho nghiên cứu 3.3.1. Động vật và nguyên liệu cho nghiên cứu
- Vịt Biển 15 – Đại Xuyên nuôi trong môi trường nước ngọt (tại cơ sở Đại Xuyên, Phú Xuyên – Hà Nội) và vịt Biển 15 – Đại Xuyên nuôi trong môi trường nước với độ mặn 2,8% (trang trại Đoàn Văn Vươn, Huyện Tiên Lãng – Thành phố Hải Phòng).
- Các loại môi trường, hóa chất cho lấy mẫu và phân lập vi khuẩn E. coli
do Viện Thú y Quốc gia cung cấp.
- Các dụng cụ thú y dùng trong mổ khám kiểm tra bệnh tích. 3.3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Văn Vươn (Hải Phòng).
- Thời gian: từ tháng 10/2016 đến 10/2017. 3.4. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.4.1.Phương pháp lấy mẫu
- Lấy mẫu phân để xác định tình hình nhiễm vi khuẩn E.coli ở 2 lứa tuổi: giai đoạn hậu bị và giai đoạn sinh sản: (15 vịt cho mỗi lứa tuổi) x 2 địa điểm lấy mẫu. Tổng số mẫu phân là 60.
- Chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu và đựng mẫu đảm bảo vô trùng, lấy >2gam phân/1mẫu. Mỗi mẫu cho vào 1 lọ thủy tinh đậy nút, cho vào túi nilông dán chặt miệng lại, đánh dấu mẫu trên từng lô.
- Các mẫu được bảo quản và chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu được phân tích không quá 12 giờ sau khi lấy.
3.4.2. Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn
- Các mẫu phân vịt được tiến hành phân lập vi khuẩn theo phương pháp thường quy tại Bộ môn vi trùng Viện Thú y, (hình 2.1).
Mẫu
Thạch máu Thạch MacConkey Nước thịt
Chọn khuẩn lạc điển hình
Thạch MacConkey
Nhuộm gram, kiểm tra hình thái Giám định các đặc tính sinh hóa
Chủng E.coli thuần khiết. Giữ giống trong môi trường BHI/Glycerin (-200C)
Xác định serotype Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh
Thạch máu
Chọn chủng kiểm tra độc lực trên chuột nhắt trắng Xử lý thích hợp
370C/ trong 24 giờ
Hình 3.1. Quy trình phân lập, giám định và xác định một vài đặc tính của vi khuẩn E.coli phân lập từ mẫu phân vịt
3.4.3. Phương pháp xác định khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập được khuẩn E.coli phân lập được
được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. * Phương pháp tiến hành:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 370C trong 24 giờ. Lấy ½ khuẩn lạc, hòa vào 1,5ml nước sinh lý để đạt được độ đục 0,5 trong dãy so màu McFarland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều trên thạch đĩa Mueller Hinton.
+ Bước 3: dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt đĩa thạch.
+ Bước 4: nuôi vi khuẩn ở 370C/18-24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra (tiêu chuẩn NCCLS). 3.4.4. Phương pháp định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí
- Các mẫu phân vịt sau khi mang về bộ môn vi trùng Viện thú y sẽ được tiến hành theo các bước sau:
+ Bước 1: Cân lấy 1g mẫu phân cho vào ống nghiệm.
+ Bước 2: Cho 9ml nước muối sinh lý 0,9%, trộn đều bằng máy lắc ta được nồng độ 10-1. Sau đó lấy 1ml dung dịch nồng độ 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý 0,9%, trộn đều bằng máy lắc ta được nồng độ 10-2. Tiếp tục như vậy cho tới khi ta có nồng độ pha loãng 10-9.
+ Bước 3: Lấy 100µl dung dịch mẫu đã pha loãng nhỏ lên trên bề mặt thạch máu, rồi dùng que cấy láng đều lên mặt thạch, ở mỗi nồng độ pha loãng 1 đĩa thạch máu. Mẫu phân thường láng ở nồng độ 10-7,10-8,10-9.
+ Bước 4: Nuôi cấy ở điều kiện 37oC. Sau từ 18h đến 24h lấy ra đọc kết quả. - Đếm số lượng khuẩn lạc ở các đĩa nuôi cấy bằng máy đọc khuẩn lạc hoặc đếm bằng mắt thường.
- Ghi lại số khuẩn lạc đếm được và nồng độ pha loãng. Tính toán theo công thức:
Tổng số VK(CFU/ml)=(Số KL đếm được) x (Nồng độ pha loãng đếm được) x 10
3.4.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm phòng bệnh do E.coli cho vịt Biển 15 – Đại Xuyên Đại Xuyên
Tiến hành thí nghiệm phòng bệnh cho vịt con (1-8 tuần tuổi). Mỗi phác đồ phòng bệnh là 50 con, vịt bố trí trong thí nghiệm được nuôi từ 1 ngày tuổi, thí nghiệm được lặp lại 2 lần các số liệu theo dõi được ghi chép đầy đủ. Tổng số vịt là 300 con.
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm phòng E.coli cho vịt Biển 15 – Đại Xuyên Nhóm Số vịt (con) Thuốc/chế phầm được dung
1 50 (x 2 lần)
Probiotic TT Prolac + TT Prolac: liều dùng 1g/1 lít nước, dùng liên tục 3 – 5 ngày.
2 50 (x 2 lần) TT.Multipro + Ampicolplus
+TT.Multipro: 1g/1 lít nước uống, dùng liên tục 3-5 ngày. Liệu trình: 2 lần/1 tháng.
+Ampicolplus: Liều phòng: 1g/1 lít nước uống hoặc trộn với 1kg thức ăn; dùng 3-5 ngày /1 tháng.
Đối chứng 50 (x 2 lần) - -
Thành phần của chế phẩm TT Prolac (trong 1kg):
Vi sinh vật: L.acidiphilus, L.reuteri, B.subits, Saccharomyces Ceresvise (min): 8x109 CFU.
Các enzyme: Protease, amylase, Glucanase, lipases (min)….10.000 UI Đường Dextrose, sữa bột, chất kết dính MR vừa đủ
Thành phần của TT Multipro (trong 1kg):
Vitamin A (min)……….. 10.000.000IU Vitamin D3 (min)………. .2.500.000IU
Vitamin E (min)……… 25.000mg Vitamin B2 (min)……… 3.000mg Vitamin B6 (min)………...600mg Vitamin B12 (min)……….. 2.000mcg Vitamin K3 (min)……… 1.000mg Biotin (min)………. 50mg Ca-Pantothenate (min-max)……… 4.500mg-5.500mg Enzyme: Almylase, Protease, Lipase, Beta-glucanase
Vi sinh vật
Lactobacillus acidophilus (min)……..9x1011 CFU Lactobacillus bulgaricus (min)………9x1011 CFU Lactobacillus casei (min)………8x1011 CFU Lactobacillus rhamnosus (min)……..8x1011 CFU Lactobacillus reuteri (min)………….1012 CFU Lactobacillus johnsoni (min)………..1012 CFU Lactobacillus Subtilis (min)…………1012 CFU Saccharomyces cerevisiae (min)…….1012 CFU Thành phần của Ampicol plus (trong 100g):
Ampicillin trihydrate : 5 000mg Colisin sulfate : 20 000 000 UI
Tá dược vừa đủ : 100g
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
3.4.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm điều trị bệnh do E.coli cho vịt Biển 15 – Đại Xuyên – Đại Xuyên
Vịt bị mắc cảm nhiễm nhất với E.coli ở giai đoạn vịt con. Việc điều trị bệnh cho vịt ở giai đoạn này gặp nhiều khó khăn do vịt có sức đề kháng yếu, khả năng chống chịu kém. Việc lựa chọn kháng sinh thích hợp để điều trị là cần thiết. Dựa trên kết quả kháng sinh đồ, chúng tôi lựa chọn một số loại thuốc chứa kháng sinh mà vi khuẩn E.coli vẫn còn mẫn cảm để điều trị.
Vịt giai đoạn 1-8 tuần tuổi được chẩn đoán mắc bệnh do E.coli dựa trên các triệu chứng bệnh tích đặc trưng của bệnh và kết quả phân lập vi khuẩn. Vịt bệnh được phân thành các nhóm và điều trị theo bảng 3.2.
Tiến hành theo dõi, ghi chép tình trạng sức khỏe, tỷ lệ chết, tỷ lệ vịt khỏi bệnh, tỷ lệ loại thải và khả năng bình phục của vịt ở các lô thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí như bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thí nghiệm điều trị bệnh do E.coli cho vịt Biển 15 – Đại Xuyên
Nhóm Thuốc Liều dung, đường đưa
1(50 con x 2) Amoxi – Lav (chứa 20 g Amoxycillin dạng Trihydrat; Bromhexine Hcl : 1g
Clavulanic Acid. Tá dược vừa đủ 100g.
Trộn vào thức ăn bữa sáng. 1,5g/1kg thức ăn; 5 ngày
Esb3 100g (chứa
Sulfachloropydazin sodium: 30mg) + tá dược vừa đủ 100 g
Trộn thức 1,5g/1kg cho ăn vào buổi sáng; dùng 2 ngày, ngừng 2 ngày sau đó trộn 2 ngày. 2 (50con x 2) Gentamicin sulfat: 100 mg Tiêm bắp 1ml/ 1con; dùng trong
5 ngày TydoC 100ml (Tylosin Tatrate 5g + Doxycillin hyclat 5g + Dexamethoxazole 15mg) Tiêm bắp 0,5-0,7ml/1con Tiềm 5 ngày Esb3 100g (chứa Sulfachloropydazin sodium: 30mg) + tá dược vừa đủ 100 g
Trộn thức 1,5g/1kg cho ăn vào buổi sáng; dùng 2 ngày, ngừng 2 ngày sau đó trộn 2 ngày.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM E.COLI TRÊN VỊT BIỂN 15 – ĐẠI XUYÊN ĐƯỢC NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC NGỌT ĐẠI XUYÊN ĐƯỢC NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC NGỌT
Qua thực tế chăn nuôi cho thấy vịt hay mắc bệnh ở giai đoạn vịt con. Đây là giai đoạn vịt dễ mẫn cảm với các bệnh môi trường khi sức đề kháng của con