3.4.1 .Phương pháp lấy mẫu
3.4.3. Phương pháp xác định khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn
khuẩn E.coli phân lập được
được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. * Phương pháp tiến hành:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 370C trong 24 giờ. Lấy ½ khuẩn lạc, hòa vào 1,5ml nước sinh lý để đạt được độ đục 0,5 trong dãy so màu McFarland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều trên thạch đĩa Mueller Hinton.
+ Bước 3: dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt đĩa thạch.
+ Bước 4: nuôi vi khuẩn ở 370C/18-24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra (tiêu chuẩn NCCLS). 3.4.4. Phương pháp định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí
- Các mẫu phân vịt sau khi mang về bộ môn vi trùng Viện thú y sẽ được tiến hành theo các bước sau:
+ Bước 1: Cân lấy 1g mẫu phân cho vào ống nghiệm.
+ Bước 2: Cho 9ml nước muối sinh lý 0,9%, trộn đều bằng máy lắc ta được nồng độ 10-1. Sau đó lấy 1ml dung dịch nồng độ 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý 0,9%, trộn đều bằng máy lắc ta được nồng độ 10-2. Tiếp tục như vậy cho tới khi ta có nồng độ pha loãng 10-9.
+ Bước 3: Lấy 100µl dung dịch mẫu đã pha loãng nhỏ lên trên bề mặt thạch máu, rồi dùng que cấy láng đều lên mặt thạch, ở mỗi nồng độ pha loãng 1 đĩa thạch máu. Mẫu phân thường láng ở nồng độ 10-7,10-8,10-9.
+ Bước 4: Nuôi cấy ở điều kiện 37oC. Sau từ 18h đến 24h lấy ra đọc kết quả. - Đếm số lượng khuẩn lạc ở các đĩa nuôi cấy bằng máy đọc khuẩn lạc hoặc đếm bằng mắt thường.
- Ghi lại số khuẩn lạc đếm được và nồng độ pha loãng. Tính toán theo công thức:
Tổng số VK(CFU/ml)=(Số KL đếm được) x (Nồng độ pha loãng đếm được) x 10
3.4.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm phòng bệnh do E.coli cho vịt Biển 15 – Đại Xuyên Đại Xuyên
Tiến hành thí nghiệm phòng bệnh cho vịt con (1-8 tuần tuổi). Mỗi phác đồ phòng bệnh là 50 con, vịt bố trí trong thí nghiệm được nuôi từ 1 ngày tuổi, thí nghiệm được lặp lại 2 lần các số liệu theo dõi được ghi chép đầy đủ. Tổng số vịt là 300 con.
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm phòng E.coli cho vịt Biển 15 – Đại Xuyên Nhóm Số vịt (con) Thuốc/chế phầm được dung Nhóm Số vịt (con) Thuốc/chế phầm được dung
1 50 (x 2 lần)
Probiotic TT Prolac + TT Prolac: liều dùng 1g/1 lít nước, dùng liên tục 3 – 5 ngày.
2 50 (x 2 lần) TT.Multipro + Ampicolplus
+TT.Multipro: 1g/1 lít nước uống, dùng liên tục 3-5 ngày. Liệu trình: 2 lần/1 tháng.
+Ampicolplus: Liều phòng: 1g/1 lít nước uống hoặc trộn với 1kg thức ăn; dùng 3-5 ngày /1 tháng.
Đối chứng 50 (x 2 lần) - -
Thành phần của chế phẩm TT Prolac (trong 1kg):
Vi sinh vật: L.acidiphilus, L.reuteri, B.subits, Saccharomyces Ceresvise (min): 8x109 CFU.
Các enzyme: Protease, amylase, Glucanase, lipases (min)….10.000 UI Đường Dextrose, sữa bột, chất kết dính MR vừa đủ
Thành phần của TT Multipro (trong 1kg):
Vitamin A (min)……….. 10.000.000IU Vitamin D3 (min)………. .2.500.000IU
Vitamin E (min)……… 25.000mg Vitamin B2 (min)……… 3.000mg Vitamin B6 (min)………...600mg Vitamin B12 (min)……….. 2.000mcg Vitamin K3 (min)……… 1.000mg Biotin (min)………. 50mg Ca-Pantothenate (min-max)……… 4.500mg-5.500mg Enzyme: Almylase, Protease, Lipase, Beta-glucanase
Vi sinh vật
Lactobacillus acidophilus (min)……..9x1011 CFU Lactobacillus bulgaricus (min)………9x1011 CFU Lactobacillus casei (min)………8x1011 CFU Lactobacillus rhamnosus (min)……..8x1011 CFU Lactobacillus reuteri (min)………….1012 CFU Lactobacillus johnsoni (min)………..1012 CFU Lactobacillus Subtilis (min)…………1012 CFU Saccharomyces cerevisiae (min)…….1012 CFU Thành phần của Ampicol plus (trong 100g):
Ampicillin trihydrate : 5 000mg Colisin sulfate : 20 000 000 UI
Tá dược vừa đủ : 100g
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
3.4.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm điều trị bệnh do E.coli cho vịt Biển 15 – Đại Xuyên – Đại Xuyên
Vịt bị mắc cảm nhiễm nhất với E.coli ở giai đoạn vịt con. Việc điều trị bệnh cho vịt ở giai đoạn này gặp nhiều khó khăn do vịt có sức đề kháng yếu, khả năng chống chịu kém. Việc lựa chọn kháng sinh thích hợp để điều trị là cần thiết. Dựa trên kết quả kháng sinh đồ, chúng tôi lựa chọn một số loại thuốc chứa kháng sinh mà vi khuẩn E.coli vẫn còn mẫn cảm để điều trị.
Vịt giai đoạn 1-8 tuần tuổi được chẩn đoán mắc bệnh do E.coli dựa trên các triệu chứng bệnh tích đặc trưng của bệnh và kết quả phân lập vi khuẩn. Vịt bệnh được phân thành các nhóm và điều trị theo bảng 3.2.
Tiến hành theo dõi, ghi chép tình trạng sức khỏe, tỷ lệ chết, tỷ lệ vịt khỏi bệnh, tỷ lệ loại thải và khả năng bình phục của vịt ở các lô thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí như bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thí nghiệm điều trị bệnh do E.coli cho vịt Biển 15 – Đại Xuyên
Nhóm Thuốc Liều dung, đường đưa
1(50 con x 2) Amoxi – Lav (chứa 20 g Amoxycillin dạng Trihydrat; Bromhexine Hcl : 1g
Clavulanic Acid. Tá dược vừa đủ 100g.
Trộn vào thức ăn bữa sáng. 1,5g/1kg thức ăn; 5 ngày
Esb3 100g (chứa
Sulfachloropydazin sodium: 30mg) + tá dược vừa đủ 100 g
Trộn thức 1,5g/1kg cho ăn vào buổi sáng; dùng 2 ngày, ngừng 2 ngày sau đó trộn 2 ngày. 2 (50con x 2) Gentamicin sulfat: 100 mg Tiêm bắp 1ml/ 1con; dùng trong
5 ngày TydoC 100ml (Tylosin Tatrate 5g + Doxycillin hyclat 5g + Dexamethoxazole 15mg) Tiêm bắp 0,5-0,7ml/1con Tiềm 5 ngày Esb3 100g (chứa Sulfachloropydazin sodium: 30mg) + tá dược vừa đủ 100 g
Trộn thức 1,5g/1kg cho ăn vào buổi sáng; dùng 2 ngày, ngừng 2 ngày sau đó trộn 2 ngày.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM E.COLI TRÊN VỊT BIỂN 15 – ĐẠI XUYÊN ĐƯỢC NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC NGỌT ĐẠI XUYÊN ĐƯỢC NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC NGỌT
Qua thực tế chăn nuôi cho thấy vịt hay mắc bệnh ở giai đoạn vịt con. Đây là giai đoạn vịt dễ mẫn cảm với các bệnh môi trường khi sức đề kháng của con vật giảm. Khi vịt mắc bệnh thì việc điều trị là đặc biệt khó khăn, tỷ lệ hao hụt cao. Vì vậy việc cần xác định một cách chính xác tỷ lệ nhiễm E.coli trên vịt Biển 15 – Đại Xuyên ở các lứa tuổi khác nhau. Kết quả lấy mẫu phân lập vi khuẩn
E.coli ở 2 giai đoạn của vịt được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả phân lập E.coli trên vịt Biển 15 – Đại Xuyên nuôi trong môi trường nước ngọt
Lứa tuổi Số mẫu Kết quả phân lập vi khuẩn Số mẫu dương tính Tỷ lệ(%)
Vịt hậu bị 15 13 86,7
Vịt đẻ 15 11 73,3
Tổng hợp 30 24 80,0
Qua bảng 4.1 cho thấy tỷ lệ nhiễm ở giai đoạn vịt hậu bị là 86,67% và vịt đẻ là 73,33%. Tỷ lệ nhiễm trung bình của vịt ở 2 lứa tuổi đạt 80%.
Kết quả cho thấy tỷ lệ phân lập rất cao, điều này có thể lý giải là trong quá trình chăn nuôi công nghiệp tập trung cao thì việc có mặt và xuất hiện của vi khuẩn E.coli là thường xuyên, chúng có mặt hầu hết trong đường tiêu hóa của vịt. Ở một điều kiện nhất định nào đó chúng có thể gây hiện tượng vịt ỉa phân trắng, khi sức đề kháng giảm chúng có thể phát bệnh và gây thiệt hại lớn về mặt kinh tế và ảnh hưởng xấu đến chất lượng đàn giống cũng như việc chọn lọc.
4.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM E.COLI TRÊN VỊT BIỂN 15 – ĐẠI XUYÊN NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC MẶN ĐẠI XUYÊN NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC MẶN
Việc đưa vịt Biển 15 – Đại Xuyên ra chăn thả ở môi trường nước mặn là một bước đột phá mới của nghành chăn nuôi trong giai đoạn biến đổi khí hậu. Vì vậy việc xác định sự có mặt của vi khuẩn E.coli ở 2 lứa tuổi trên vịt Biển 15 – Đại Xuyên là hết sức cần thiết, từ đó chúng ta có thể đưa ra được hướng phòng
bệnh cho đàn vịt tại môi trường nước mặn. Tiến hành lấy mẫu và phân lập, giám định vi khuẩn, kết quả được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4. 2. Kết quả phân lập E.coli trên vịt Biển 15 – Đại Xuyên nuôi trong môi trường nước mặn
Lứa tuổi Số mẫu Kết quả phân lập vi khuẩn Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%)
Vịt hậu bị 15 14 93,3
Vịt đẻ 15 13 86,7
Tổng hợp 30 27 90
Bảng 4.2 cho thấy tỷ lệ nhiễm ở giai đoạn vịt hậu bị là 93,3,% và vịt đẻ là 86,7%. Tỷ lệ nhiễm trung bình của vịt ở 2 lứa tuổi đạt 90%. Từ kết quả ở bảng 4.1 và bảng 4.2, ta có những kết quả sau:
Có sự khác nhau về tỷ lệ nhiễm E.coli trên cùng một độ tuổi của vịt nuôi trong hai môi trường. Vịt nuôi trong môi trường nước mặn có tỷ lệ nhiễm E.coli
cao hơn ở vịt nuôi trong môi trường nước ngọt (tỷ lệ mẫu dương tính tương ứng là 93,3% và 86,7% với vịt hậu bị; 86,7% và 73,3% với vịt đẻ.
Trong cùng một môi trường nuôi, tỷ lệ vịt nhiễm E.coli ở nhóm vịt đẻ thấp hơn ở nhóm vịt hậu bị; ở nước ngọt là 86,7% (vịt hậu bị) giảm xuống 73,3% (vịt đẻ); ở nước mặn là 93,3% (vịt hậu bị) giảm còn 86,7% (vịt đẻ).
Theo Adzitey et al. (2012), phân lập 150 mẫu bệnh phẩm từ vịt khỏe cho kết quả 115 mẫu dương tính với E.coli chiếm tỷ lệ 78%. Tỷ lệ nhiễm E.coli ở từng loại bệnh phẩm là khác nhau, trong đó mẫu bệnh phẩm phân cho tỷ lệ cao nhất (87,93%). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả này khi lấy mẫu bằng phương pháp lấy mẫu phân trực tràng.
Phân lập 120 mẫu tăm bông trực tràng vịt (60 mẫu từ vịt ở Nepal và 60 mẫu từ vịt Bangladesh) để xác định sự có mặt của vi khuẩn E.coli. Kết quả có 40/60 mẫu dương tính với E.coli, chiếm 66,67% từ mẫu phân vịt lấy ở Nepal. Bangladesh cho tỷ lệ mẫu dương tính cao hơn với 45/60 mẫu (75%) (Avishek et al., 2012).
Theo nghiên cứu của Lê Văn Đông (2011), tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli
trên vịt chạy đồng tại tỉnh Trà Vinh ở 3 lứa tuổi trong 4 năm từ 2007-2010 là: giai đoạn vịt con tỷ lệ nhiễm 60,14%, tiếp theo là giai đoạn vịt hậu bị 25,19% và
thấp nhất ở giai đoạn vịt đẻ (14,67%). Khi phân lập E.coli trên vịt chạy đồng theo huyện cho thấy tỷ lệ nhiễm E.coli từ 62,97%-64,29%, Trung bình chiếm 63,39% mẫu dương tính với E.coli. Đánh giá tỷ lệ nhiễm E.coli theo lứa tuổi ở các huyện của tỉnh Trà Vinh cho thấy: tỷ lệ nhiễm E.coli cao nhất ở giai đoạn vịt đẻ 87,68%, tiếp theo là đến giai đoạn vịt thịt 67,27%, thấp nhất là giai đoạn vịt con 47,06% (P>0,05).
Theo Nguyễn Trọng Phước (1997), phân lập vi khuẩn E.coli tại tỉnh Long An cho thấy: giai đoạn vịt con tỷ lệ nhiễm E.coli là 71,66%, vịt thịt là 83,33%.
Tỷ lệ nhiễm E.coli trên vịt ở các nghiên cứu trong nước và nước ngoài thấp hơn trong nghiên cứu này, có thể lý giải liên quan đến điều kiện môi trường chăn nuôi và phương thức chăn nuôi khác nhau nên sự có mặt của vi khuẩn
E.coli là khác nhau. Tại các tỉnh Miền Nam do phương thức nuôi chạy đồng, cùng với mật đôi nuôi thấp và điều kiện khí hậu tốt nên tỷ lệ nhiễm E.coli là thấp. Xong kết quả trong nghiên cứu này là hoàn toàn phù hợp với đặc điểm dịch tễ của bệnh. Bệnh xảy ra ở giai đoạn vịt hậu bị cao hơn so với giai đoạn vịt đẻ. Từ kết quả trên cho thấy, chăn nuôi công nghiệp tập trung mật độ cao luôn là mối đe dọa về dịch bệnh, nhất là các bệnh liên quan đến môi trường.
Tỷ lệ nhiễm E.coli cao không đồng nghĩa với việc bùng phát dịch bệnh vì vi khuẩn E.coli thường xuyên có mặt trong đường ruột, ở một mức độ nào đó nó chỉ gây tiêu chảy phân trắng, không gây chết. Song việc xác định độc lực và yếu tố gây bệnh là cần thiết. Một số chủng E.coli có serotype O có khả năng gây bệnh.
Hình 4.1.Hình ảnh vi khuẩn E.coli dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần
Hình 4.2.Hình thái khuẩn lạc
4.3. TỔNG SỐ VI KHUẨN E.COLI CÓ TRONG MẪU PHÂN VỊT BIỂN 15 – ĐẠI XUYÊN NUÔI TẠI HAI MÔI TRƯỜNG NƯỚC KHÁC NHAU – ĐẠI XUYÊN NUÔI TẠI HAI MÔI TRƯỜNG NƯỚC KHÁC NHAU
Để đánh giá ảnh hưởng của môi trường nước nói chung và nồng độ muối nói riêng đến mức độ nhiễm E.coli ở vịt Biển 15 – Đại Xuyên, chúng ta tiến hành xác định tổng số vi khuẩn E.coli của 12 mẫu phân trong đó có 6 mẫu phân được lấy từ môi trường nước ngọt và 6 mẫu phân được lấy từ môi trường nước mặn. Kết quả được trình bày ở bảng 4.3
Bảng 4.3. Kết quả xác định tổng số vi khuẩn E.coli trong phân vịt Biển 15 – Đại Xuyên
Tổng số vi khuẩn E.coli/g phân
TT Mẫu Mẫu phân vịt nước ngọt TT Mẫu Mẫu phân vịt nước mặn
1 2 x 108 1 21 x 108 2 7 x 108 2 29 x 108 3 5 x 108 3 31 x 108 4 2,5 x 108 4 35 x 108 5 3,8 x 108 5 40 x 108 6 2,4 x 108 6 23 x 108 Trung bình 3,78 x 108 Trung bình 29,83 x 108
Bảng 4.3 cho ta thấy trung bình tổng số vi khuẩn E.coli xác định được trên 1g phân vịt Biển nuôi trên môi trường nước mặn (29,83 x 108) cao hơn rất nhiều so với trên 1g phân vịt Biển nuôi trên môi trường nước ngọt (3,78 x 108). Kết quả này trái với suy đoán ban đầu, khi đưa vịt ra môi trường nước mặn nuôi thì tổng số vi khuẩn E.coli/g phân vịt sẽ giảm xuống.
4.4. KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG E. COLI
PHÂN LẬP ĐƯỢC
Khi vịt mắc bệnh, việc điều trị là khó khăn, chúng ta không thể tách từng con để điều trị mà phải điều trị toàn đàn. Vịt nuôi tập trung, mật độ cao thì khả năng phát bệnh trên toàn đàn là rất nhanh cả về tình trạng và tính chất bệnh. Lựa
chọn các loại kháng sinh thích hợp, giúp cho công tác điều trị bệnh trên vịt hiệu quả cao là cần thiết và quan trọng, mặt khác hạn chế tình trạng sử dụng kháng sinh không hợp lý dẫn đến hiện tượng kháng thuốc. Xác định mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập tại thực địa được chú trọng và để làm cơ sở cho lựa chọn thuốc điều trị phù hợp. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân lập 30 chủng E.coli từ phân vịt nước mặn và 30 chủng E.coli từ phân vịt nuôi tại môi trường nước ngọt để kiểm tra mẫn cảm kháng sinh. Các kháng sinh đang được dùng rộng rãi trong chăn nuôi được sử dụng trong nghiên cứu này (14 loại kháng sinh). Kết quả đánh giá tính mẫn cảm kháng sinh được trình bày ở bảng 4.4.
Kiểm tra khác sinh đồ cho kết quả:
Vi khuẩn E.coli mẫn cảm với 14 loại kháng sinh là thấp, hầu hết các chủng E.coli kháng các loại kháng sinh từ 0% – 100%. Với 30 chủng E.coli
kiểm tra trên môi trường nước ngọt chúng ta có thể thấy tỷ lệ kháng kháng sinh quá cao với kết quả kháng 100% với 9/14 loại kháng sinh được kiểm tra . Tiếp theo kháng Trimethoprim + Sulfamethoxazone 90%, Colistin 83,3%, Gentamycin là 56,7%, Tylosin 46,7%. Ngoại trừ Amoxicillin – kháng sinh thuốc nhóm β –lactam cho tỷ lệ mẫn cảm cao 100%. Đây là một trong những điều cực kì đáng lo ngại, cho chúng ta thấy tỷ lệ kháng kháng sinh ở các loại vi khuẩn đang gia tăng rất cao.
Hình 4. 3.Khả năng mẫn cảm và kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập từ vịt Biển 15 – Đại Xuyên
Bảng 4.4. Kết quả kháng sinh đồ
Kháng sinh Ecoli từ phân vịt nước mặn Ecoli từ phân vịt nước ngọt Số chủng
kiểm tra Số chủng kháng Tỷ lệ (%) Số chủng kiểm tra Số chủng kháng Tỷ lệ (%) Amoxicillin/ Clavulanic acid 30 0 0 30 0 0 Ampicillin 30 30 100 30 30 100 Flumequin 30 30 100 30 30 100 Doxyciclin 30 16 53,3 30 30 100 Colistin 30 15 50 30 25 83,3 Ceftiofur 30 25 83,3 30 30 100 Gentamycin 30 10 33,3 30 17 56,7 Norfloxacin 30 30 100 30 30 100 Oxytetracyclin 30 30 100 30 30 100