Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.5. Phương pháp PCR
3.5.5.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ bệnh phẩm theo bộ kít DNeasy Blood & Tissue của QIAGEN. Các mẫu bệnh phẩm trước khi tiến hành tách chiết DNA được giải đông ở nhiệt độ phòng. Tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm là các cơ quan, tổ chức theo quy trình sau:
Bước 1: Cân khoảng 25 mg mô bào và cắt thành những mảnh nhỏ đựng trong ống ly tâm 1,5 ml, cho thêm 180 µl dung dịch đệm ALT.
Bước 2: Thêm 20 µl proteinase K, trộn bằng máy vortex và ủ ở 560C tới khi tế bào tan hoàn toàn (khoảng 2 giờ). Trong quá trình ủ mẫu thường xuyên lắc mẫu để mẫu phân tán hoàn toàn. Trộn bằng máy vortex trong 15 giây. Thêm 200 µl Buffer AL vào mẫu, trộn đều bằng máy vortex.
Bước 3: Thêm 200 µl ethanol (100%), trộn bằng máy vortex trong 15 giây.
Bước 4: Chuyển phần dịch pha trộn từ bước 3 trên vào cột DNeasy Mini spin, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 5: Đặt cột vào ống 2 ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500 µl Buffer AW1 không để rơi lên thành, miệng, đóng nắp và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 6: Đặt cột vào ống 2 ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500 µl Buffer AW2 và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 7: Đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới. Thêm 200 µl đệm AE trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới. Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa DNA tổng số. Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C.
3.5.5.2. Phương pháp PCR
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cặp mồi (HIS5F, HIS5R) với gen 18S rRNA của Histomonas sp.
Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần và thể tích theo kit Promega được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl)
Go taq green 12.5
Mẫu DNA 5
Mồi xuôi (HISF5F) 0.5
Mồi ngược (HISR5R) 0.5
Nước cất 6,5
Tổng thể tích 25
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau: Bảng 3.1. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR
Giai
đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (
oC) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 95 2 phút 1
2
Duỗi mạch 95 35 giây
40
Gắn mồi 55.5 35 giây
Tổng hợp sợi mới 72 45 giây
3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
3.5.5.3. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
* Chuẩn bị thạch
- Chuẩn bị bình thủy tinh nấu thạch. Bổ sung 100 ml đệm TBE 1X. Thêm 1,5 g thạch Agarose. Hấp thạch 1000C/5 phút. Để nguội đến 400C – 500C. Bổ sung 1μl Ethidium bromide (10 mg/ml), trộn đều. Đổ thạch ra khay gắn lược. Chờ 30 phút cho thạch đông lại. Rút lược, cắt thành miếng thạch mong muốn.
* Chạy điện di
- Đặt thạch vào bể điện di. Đổ dung dịch TBE 1X ngập bản gel khoảng 3-5 mm. Dùng pipet hút bỏ hết không khí tại các giếng thạch. Dùng pipet hút 8 μl sản phẩm của PCR vào các giếng. Nhỏ 6 μl DNA Marker/1 giếng riêng biệt để làm thang đo. Đậy nắp, nối cực dòng điện (màu đen là cực âm, màu đỏ là cực dương). Cắm điện, bật nguồn. Điều chỉnh máy điện di chạy ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA trong 30 phút. Bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng các vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
Đọc kết quả: dương tính ứng với 209bp xuất hiện band sáng, âm tính ứng với 209bp không xuất hiện band sáng