Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý và quan sát bệnh tích vi thể
Mẫu bệnh phẩm được lấy từ các cơ quan, tổ chức của gà mắc Histomonsas sp. được ngâm trong formol 10% làm tiêu bản vi thể. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE). Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Cố định bệnh phẩm: Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%.
Vùi bệnh phẩm: Tiến hành lần lượt các bước sau: Rửa focmol, rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h. Đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động. Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình
Bình Hóa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00
Đúc block: Đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản: Cắt mảnh: bằng máy microtom.
Tãi mảnh: Dàn lát cắt bằng phẳng trên phiến kính trong nước ấm 480C. Sau đó để tủ ấm 370C đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm được.
Nhuộm tiêu bản: Các bước tiến hành
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 6h; Xylen II: 6h; Xylen III: 12h
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000: 2 lần (mỗi lần 1 phút); Cồn 950: 1 lần; Cồn 700: 1 lần; Cồn 500:1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút.
+ Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân): Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước. Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn: Cồn 500: 1 lần; Cồn 700: 1 lần; Cồn 950: 1 lần; Cồn 1000: 2 lần
Rửa tiêu bản
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương): Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút, rửa nước. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản đi qua xylen .
Gắn Baume canada: Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học.