4.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY, PHÂN LẬP VI KHUẨN SALMONELLA
Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã tiến hành lấy ngẫu nhiên60 mẫu thịt (30 mẫu thịt lợn, 30 mẫu thịt gà) vào buổi sáng sớm (7 giờ sáng) tại 3 chợ đầu mối thuộc nội thành Hà Nội để phân lập và xác định đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella spp. có mặt trong các mẫu bị ô nhiễm.
4.1.1. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong mẫu thịt
lợn, gà
Salmonella là một loại vi khuẩn sống trong phủ tạng của gia cầm, gia súc
và tràn vào thịt khi những con vật này bị mổ. Chúng cũng có mặt ở phân và dễ dàng "đột nhập" vào trứng gia cầm qua những lỗ nhỏ li ti ở vỏ.
Salmonella là một trong những thủ phạm chính gây ngộ độc thực phẩm
vào mùa hè. Ngộ độc do Salmonella có thể biểu hiện từ nhẹ cho tới rất nghiêm trọng và thậm chí gây tử vong.Việc phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn
Salmonella trong thức ăn nói chung và các sản phẩm thịt gia súc, gia cầm nói
riêng là việc làm hết sức quan trọng.
Dựa trên tiêu chuẩn của FAO và quyết định số 867/QĐ - BYT của bộ trưởng Bộ Y tế ngày 04/4/1998 thì vi khuẩn Salmonella không được phép có mặt trong 25 gram thực phẩm (thịt tươi, sản phẩm chế biến từ thịt), vì vậy chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra định tính sự có mặt của vi khuẩn này trong các mẫu, chứ không kiểm tra định lượng, từ đó xác định tình trạng ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm có nguồn gốc từ thịt trên địa bàn Hà Nội. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp. từ các mẫu thịt
Loại thịt Số mẫu kiểm
tra Kết quả Số mẫu dương tính Tỷ lệ % Thịt lợn 30 6 20,0 Thịt gà 30 7 23,3 Tổng hợp 60 13 21,67
Kết quả bảng 4.1 cho thấy: tỷ lệ dương tính với Salmonella khá cao, trong tổng số 60 mẫu được kiểm tra có 13 mẫu thịt đã phân lập được vi khuẩn
Salmonella spp. chiếm tỷ lệ 21,67%. Trong đó, tỷ lệ phân lập Salmonella spp. ở
thịt gà chiếm tỷ lệ 23,3 % cao hơn ở thịt lợn chiếm tỷ lệ 20,0%. Đây là điều đáng lo ngại cho sức khoẻ cộng đồng vì theo TCVN 7046: 2009 quy định, trong thịt và sản phẩm của thịt không được phép có mặt vi khuẩn Salmonella. Như vậy, nếu căn cứ theo các quy định trên và trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này thì có tới 21,67% các mẫu thịt không đạt tiêu chuẩn. Điều này đã giải thích được tại sao vẫn có những vụ ngộ độc thực phẩm liên tục xảy ra trong cả nước trong thời gian qua.
Theo thống kê của Bộ Y tế, chỉ trong 4 tháng đầu năm 2016, cả nước đã xảy ra gần 30 vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, làm trên 1.386 người bị ngộ độc, trong đó có 2 trường hợp tử vong. Riêng trong tháng 4/2016 đã xảy ra 9 vụ ngộ độc thực phẩm, làm 375 người bị ngộ độc. Hầu hết các bệnh nhân bị ngộ độc do ăn phải thức ăn bị nhiễm vi sinh vật bởi thời tiết nóng bức gây ra, cùng với đó là một số trường hợp bị ngộ độc do hấp thụ phải hóa chất tồn dư trong thực phẩm (Minh Thùy, 2016).
Nếu xét riêng tỷ lệ của từng loại thịt thì thấy 20% mẫu thịt lợn và 23,3% mẫu thịt gà đã được xác định là có nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. Nói một cách khác, nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm cho người từ thịt gà bị nhiễm Salmonella
spp. cao hơn so với thịt lợn. Kết quả này tương đương với một số nghiên cứu mới được công bố gần đây. Trong một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn khác nhau trong thịt tươi tại các chợ tự do trên địa bàn Hà Nội, Đỗ Ngọc Thúy và cs. (2006) đã xác định được tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. trung bình trong thịt là 30% (trong đó có 47,1% ở thịt gà, 27,3% ở thịt lợn và 19% ở thịt bò).Nhóm các nhà khoa học thuộc Viện Paster thành phố Hồ Chí Minh đã thực tế lấy ngẫu nhiên 1.150 mẫu thực phẩm thịt heo, gà, bò tươi sống tại các chợ trên địa bàn Tp.HCM để xét nghiệm. Kết quả cho thấy, 385 mẫu thịt nhiễm khuẩn
Salmonella. Trong đó, tỷ lệ nhiễm khuẩn Salmonella trong thịt lợn cao nhất
chiếm 39,20% (98/250 mẫu), thịt gà chiếm 35,17% (211/600 mẫu), thịt bò 30,80% (77/250 mẫu). Tính trung bình, tỷ lệ thịt động vật tươi sống bày bán tại các chợ nhiễm khuẩn Salmonella tới 32,26% (Diệu Linh, 2012).
Theo chúng tôi, sự khác nhau này có thể do nhiều nguyên nhân, trong đó nguyên nhân thịt bị nhiễm Salmonella là do việc giết mổ, gia súc - gia cầm ở địa bàn Hà Nội phần lớn là do tư nhân đảm nhiệm, địa điểm giết mổ mang tính tạm bợ, thường tận dụng vỉa hè, lòng đường, sân nhà, dụng cụ không có gì ngoài dao, xô, chậu, nguồn nước trong quá trình giết mổ bị ô nhiễm. Theo Browkaj (1989), khi chọc tiết bằng dao nhiễm khuẩn hoặc nhúng lợn vào nước lúc tim còn co bóp, vi khuẩn sẽ chuyển vào mạnh máu, lâm ba đến các bắp thịt. Thịt sau khi mổ được vận chuyển đơn sơ, không bao gói bảo quản, thêm vào đó, việc bày bán tự do ở chợ suốt cả ngày, người mua, người bán có thể nâng lên, đặt xuống để lựa chọn, mặc cả, đã làm cho thịt càng dễ bị nhiễm vi khuẩn. Nhận định này của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của một số tác giả cho rằng thịt bị ô nhiễm Salmonella
sau khi giết mổ, kiểm tra thấy sự nhiễm khuẩn lớn hơn do bị nhiễm khuẩn là từ phân, da, lông, móng, chất chứa trong ruột, dụng cụ cắt thịt, khay đựng, không khí, đất nước của lò mổ, ngoài ra còn có sự nhiễm khuẩn từ quần áo, chân tay công nhân(Phùng Thị Ánh Mai, 2013).
Riêng tỉ lệ nhiễm khuẩn Salmonella trên thịt gà thường cao hơn thịt lợn. Ở các điểm giết mổ đã khảo sát, gà được vặt lông và mổ trực tiếp trên nền xi măng, không có sự cách ly rõ ràng giữa khu vực làm lông và moi ruột nên không thể tránh được nhiễm vi khuẩn vào thân thịt. Những nghiên cứu trước đây cho biết lây nhiễm chéo xảy ra đặc biệt trong quá trình nhúng nước, làm lông, mổ lấy lòng và chặt cổ cánh (Bryan and Doyle, 1995; Humphrey, 2000).
4.1.2. Kết quả giám định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn
Salmonella spp. phân lập được
Dựa trên đặc tính sinh học khác nhau của mỗi loài vi khuẩn như: tính chất mọc trên các môi trường thông thường, môi trường đặc biệt, khả năng chuyển hóa đường, khả năng sản sinh các hợp chất sinh học trung gian trong quá trình phát triển ở môi trường nuôi cấy... có thể sử dụng những đặc điểm này để phát hiện, nhận biết chúng. Trong nghiên cứu này, vi khuẩn Salmonella được nuôi cấy, phân lập trên các loại môi trường: BPW, Rambach agar, MK, XLT4 agar, Kligler agar.
Bảng 4.2. Kết quả giám định đặc tính nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của
các chủng Salmonellaspp. trong quá trình phân lập
STT Chỉ tiêu kiểm tra Số chủng Đặc điểm Kết quả (+) Tỷ lệ (%)
1 BPW 13 Môi trường đục đều 13 100 2 MSRV 13
Vi khuẩn phát triển lan rộng ra xung quanh giọt canh khuẩn tạo 1 vầng trắng, có thể lan khắp bề mặt thạch.
13 100 3 MK 13 Môi trường đục 13 100 4 Rambach
agar 13
Khuẩn lạc có kích thước trung bình, dạng S, màu hồng cánh sen, không làm biến đổi màu môi trường
7 53,85
5 XLT4
agar 13
Khuẩn lạc có kích thước trung bình,
dạng S, màu đen 6 46,15
Hình 4.2. Vi khuẩn Salmonella trên môi trường thạch XLT4
Hình 4.3. Vi khuẩn Salmonella trên môi trường thạch Rambach
Sau khi xác định đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella
trên, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của chúng. Kết quả được trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của các chủng
vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được
STT Đặc tính sinh hóa Số mẫu
kiểm tra Số mẫu dương tính (+) Tỷ lệ (%) Theo ISO 6579 – 2005 1 Glucose 13 13 100 + 2 Lactose 13 0 0 - 3 H2S 13 13 100 + 4 Sinh hơi 13 10 76,92 +/- 5 Simmoncitrate 13 13 100 + 6 Ureaza broth 13 0 0 - 7 Lysine decarboxylase broth 13 13 100 +
Từ bảng 4.3 cho thấy: 100% các chủng Salmonella được kiểm tra đều dương tính với glucose, H2S, Simmoncitrate, Lysine decarboxylase broth và không có chủng nào lên men đường lactose và Ureaza broth. Có 10/13 chủng có khả năng sinh hơi tương ứng với 76,92%.
Hình 4.5. Vi khuẩn Salmonella trên môi trường thạch Kligler
Hình 4.6. Vi khuẩn Salmonella trong môi trường Lysine decarboxylase
Hình 4.7. Vi khẩn Salmonella trên môi trường thạch nghiêng Simmoncitrate
Như vậy, đặc tính sinh vật hoá học của các chủng Salmonella spp. phân lập được mang đặc điểm chung của giống Salmonella và phù hợp với những đặc điểm về hình thái, nuôi cấy, đặc tính sinh hoá của vi khuẩn này theo như mô tả của Quinn et al. (2004), cũng như các tác giả khác như: Phùng Quốc Chướng (1995), Cù Hữu Phú và cs. (2000),Đỗ Trung Cứ (2004) khi nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella.
4.2. KẾT QUẢ KIỂM TRA KHẢ NĂNG MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINH
CỦA VI KHUẨN SALMONELLA PHÂN LẬP ĐƯỢC
Với sự tiến bộ mạnh mẽ của khoa học sinh học, hàng loạt các kháng sinh đã được phát hiện và sản xuất theo con đường sinh học và tổng hợp hóa học. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh có nhiều thành công và đem lại hiệu quả kinh tế, việc dùng kháng sinh không đúng liều lượng, liệu trình và kết hợp nhiều loại kháng sinh đã đồng thời tạo nên áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn. Hiện tượng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm lo lắng của toàn xã hội. Vi khuẩn kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết các kháng sinh dùng trong lâm sàng. Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn này còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác.
Mười bachủng vi khuẩn Salmonella phân lập được kiểm tra mức độ mẫn cảm với 10 loại kháng sinh và hóa dược thông dụng, kết quả kiểm tra và đánh giá theo phương pháp của Kirby-Bauer (1996). Kết quả được thể hiện ở biểu đồ hình 4.9.
Hình 4.9. Tần số kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân
Kết quả biểu đồ hình 4.9 cho thấy: Các chủng Salmonella được lựa chọn kháng hoàn toàn với cephalothin (chiếm tỷ lệ 100%), kháng cao với một số kháng sinh như: streptomycine (chiếm tỷ lệ 84,6%), tetracycline (chiếm tỷ lệ 61,5%), tiếp theo là kháng amoxicillin (53,8%), trimethoprime/sulfamethoxazol (53,8%), ampicillin (53,8%), chloramphenicol (46,2%).
Bên cạnh những kháng sinh đã bị kháng với tỷ lệ cao, các chủng vi khuẩn
Salmonella được thử vẫn rất mẫn cảm với gentamycin và ceftazidine (với tỷ lệ
100%), tiếp sau là ciprofloxacin (84,6%).
Với tỷ lệ ô nhiễm ở thân thịt cao, các Salmonella kháng kháng sinh trở thành nguồn lan truyền đặc tính kháng thuốc ra môi trường và đến người tiêu dùng theo chuỗi phân phối thịt lợn, thịt gia cầm. So sánh với một số nghiên cứu trước đây cho thấy kết quả kháng kháng sinh cao hơn với nghiên cứu này. Theo Thai and Yamaguchi (2012) tỷ lệ kháng tetracycline (54,5 %), streptomycin (41,5 %), chloramphenicol (35,6 %), và ampicillin (33,1 %). Trong khi nghiên cứu của Nguyễn Viết Không và cs. (2012) cho thấy tỷ lệ kháng thuốc của Salmonella
spp. đối với các nhóm kháng sinh khác đang ngày càng tăng, đặc biệt là những kháng sinh mới thuộc nhóm quinolones (A. nalidic, ciprofloxacin), trimethoprim/ sulfamethoxazole: trimethoprim (80%), nalidixic axit (62,22%),ciprofloxacin (35,56%). Điều này cho thấy việc lạm dụng kháng sinh quá nhiều, kể cả những loại kháng sinh thế hệ mới trong chăn nuôi.
Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng này. Bên cạnh việc sử dụng tràn lan nhiều loại kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi, việc lạm dụng kháng sinh để phòng và chữa bệnh cho động vật cũng đáng báo động. Điều này gây ra không ít khó khăn cho ngành thú y và cả nhân y vì yếu tố kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella luôn thay đổi theo thời gian, không gian khác nhau ở từng cá thểbởi các gen nằm trong plasmid (resistance).Ở các nước phát triển, hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella từ động vật sang người chủ yếu do việc sử dụng kháng sinh bừa bãi trong thức ăn chăn nuôi (Threlfall, 2002).
Vì vậy, trong từng thời gian nhất định, cần phải làm kháng sinh đồ để xác định chính xác khả năng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, ngoài mục đích lựa chọn kháng sinh mẫn cảm trong điều trị, còn để kiểm tra khả năng gây bệnh và độc lực của chủng vi khuẩn phân lập.
Ngày nay, vi khuẩn không chỉ kháng một loại thuốc kháng sinh mà có thể kháng lại nhiều loại thuốc kháng sinh cùng một lúc, khiến cho việc điều trị trở
nên khó khăn hơn. Mức độ kháng của 13 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được với 10 loại kháng sinh thông dụng được thể hiện ở bảng 4.4 và bảng 4.5.
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm với một số loại kháng
sinh của các chủng vi khuẩn Salmonellaspp. phân lập được
TT Mẫu Kết quả kháng/KS KS kiểm tra Sm Am Bt CF C Ax Ge Te Ci Cz 1 G1 R R S R S R S S I S 4/10 2 G2 R I S R S R S R S S 4/10 3 G3 R I S R R R S S S S 4/10 4 G4 R S R R S S S R I S 4/10 5 G5 I R R R S S S R S S 4/10 6 G6 R R S R S R S R S S 5/10 7 G7 R S R R R S S R S S 5/10 8 L1 R R S R R R S S S S 5/10 9 L2 I I S R S S S S S S 1/10 10 L3 R R R R R S S S S S 5/10 11 L4 R R R R S R S R S S 6/10 12 L5 R R R R R R S R S S 7/10 13 L7 R I R R R S S R S S 5/10
R: Kháng; I: Trung gian; S: Nhạy cảm
Sm: Streptomycine, Am: Ampicillin, Bt: Trimethoprime/Sulfamethoxazol; CF: Cephalothin, C: Chloramphenicol, Ax: Amoxicillin, G: Gentamycin, Te: Tetracycline, Ci: Ciprofloxacin, Cz: Ceftazidine.
Bảng 4.5. Mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập được Mức độ
kháng KS Số chủng kiểm tra Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Ký hiệu
Kháng 1 loại 13 1 7,69 L2 Kháng 4 loại 5 38,46 G1, G2, G3, G4, G5 Kháng 5 loại 5 38,46 G6, G7, L1, L3, L7 Kháng 6 loại 1 7,69 L4 Kháng 7 loại 1 7,69 L5
Kết quả bảng 4.4 cho thấy: trong số 13 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được kiểm tra mức độ mẫn cảm với kháng sinh, ngoại trừ chủng L2 đều có khả năng đa kháng kháng sinh với 4 – 7 loại kháng sinh. Và theo kết quả bảng 4.5, đa số các chủng kháng 4 -5 loại kháng sinh (chiếm tỷ lệ 38, 46%), kháng 6-7 loại kháng sinh chiếm tỷ lệ 7,69%.
Kết quả về tính đa kháng kháng sinh của nghiên cứu này tương đồng với những nghiên cứu trước đây. Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được 437 chủng Salmonella từ thịt bò, lợn, gà tươi sống. Các chủng này đã được xác định kháng kháng sinh. Trong đó có ít nhất 61 chủng Salmonella đa kháng, kháng ít nhất 5 loại kháng sinh thường dùng trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn gram âm gây ra và kháng ít nhất 2 kháng sinh cephalosporin phổ rộng như cefoxitin (Diệu Linh, 2012).
Như vậy, với tình trạng sử dụng kháng sinh không được kiểm soát tốt, sự xuất hiện của vi khuẩn đa kháng và kháng hoàn toàn các kháng sinh đang sử dụng hiện nay là hoàn toàn có thể xảy ra. Trong những năm gần đây, xét nghiệm vi khuẩn Salmonella phân lập được từ Hoa Kỳ và các nước khác đã chỉ ra rằng tỷ lệ ngày gia tăng các chủng đa kháng (Chen et al., 2004).
Do đó, chúng ta cần những biện pháp hạn chế sự kháng thuốc của vi khuẩn. Ủy ban tư vấn về an toàn vi sinh trong thực phẩm vương quốc Anh (ACMSF) khuyến cáo rằng một chính phủ sắp xếp chiến lược hướng tới việc giảm bớt việc sử dụng kháng sinh trong thú y, bao gồm cả việc công bố các quy định đối với những kháng sinh đặc biệt, và đưa ra một báo cáo tổng hợp hàng năm tóm tắt về sự kháng thuốc trong chuỗi thực phẩm phải được đưa ra bởi các tổ chức giám sát kháng thuốc kháng sinh ở người và thực phẩm có nguồn gốc động vật. Cuối cùng, báo cáo khuyến nghị tập trung nâng cao giáo dục đào tạo về