Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3. Phương pháp định typ bằng phản ứng huyết thanh học
Tiến hành định typ chủng vi khuẩn Salmonellađa kháng thuốc trong đó có 2 loại kháng sinh chloramphenicol và tetracyclinebằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm với kháng huyết thanh chuẩn (hãng Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo, Nhật Bản). Trên cơ sở kết quả thu được, tiến hành định danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại (Kauffmann and White Popoff, 2001)
* Chuẩn bị vi khuẩn Salmonella
Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonellatừ môi trường đặc hiệu (XLT4 hoặc Rambach), ria cấy lên ống thạch Nutrient agar đã chuẩn bị, bồi dưỡng 370C qua đêm.
* Tiến hành
- Đinh type kháng nguyên O
Thử kháng huyết thanh đa giá poly O
• Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh polyvalent O (20 µl) lên phiến kính
• Nhỏ 1 giọt nước sinh lý lên vị trí khác trên phiến kính
• Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonellađã nuôi cấy qua đêm trên môi trường Nutrient agar trộn đều vào 2 giọt kháng huyết thanh và nước sinh lý trên phiến kính.
• Lắc nhẹ phiến kính 5-10s (20 lần)
• Quan sát:
Phản ứng dương tính: Có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti.
Phản ứng âm tính: Huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục
Nhóm và đơn giá kháng huyết thanh O
Tiến hành với các nhóm OMA, OMB, OMC,... tương tự kháng huyết thanh poly O. Với nhóm cho phản ứng dương tính, tiếp tục với các kháng huyết thanh O đơn giá.
Ví dụ: OMA dương tính, tiếp tự với kháng huyết thanh đa giá O 3,10,15; O 9; O4,5, Nếu O 3,10,15 dương tính, tiếp tục với huyết thanh đơn giá O 3, O 10, O15.
-Đinh type kháng nguyên H
Nhiều chủng Salmonellacó 2 pha kháng nguyên H. Tuy nhiên ở vi khuẩn
ức chế sự xuất hiện của pha1 bằng cách nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh ức chế pha 1 vào đĩa thạch Sven Gard.
Pha 1: Tiến hành tương tự như kháng nguyên O với kháng huyết thanh đa giá poly H, kháng huyết thanh nhóm H (HMA, HMB, HMC), kháng huyết thanh đơn giá H.
Pha 2:
- Chuẩn bị thạch Sven Gard: Đây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dùng đĩa petri có đường kính 9mm. Trước khi đổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ kháng huyết thanh Sven Gard với mục đích ức chế pha 1. Tuỳ theo pha 1 mà có loại kháng huyết thanh Sven Gard khác nhau (SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6) SG1: ức chế Ha, Hb, Hc, H z10 SG2: ức chế Hd, Hi, He,h SG3: ức chế Hk, Hy, Hl,w, Hl,z13, Hl,z26 SG4: ức chế Hr, Hz SG5: ức chế He,n,x, He,n,z15 Sg6: ức chế H1,2, H1,5, H1,6, H1,7, Hz6
- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn đã xác định được kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở vị trí giữa đĩa thạch Sven Gard.
- Bồi dưỡng 370C/24h.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1.