4.1 .Kết quả nuôi cấy, phânlập vi khuẩnSalmonella
4.2. Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn salmonella
CỦA VI KHUẨN SALMONELLA PHÂN LẬP ĐƯỢC
Với sự tiến bộ mạnh mẽ của khoa học sinh học, hàng loạt các kháng sinh đã được phát hiện và sản xuất theo con đường sinh học và tổng hợp hóa học. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh có nhiều thành công và đem lại hiệu quả kinh tế, việc dùng kháng sinh không đúng liều lượng, liệu trình và kết hợp nhiều loại kháng sinh đã đồng thời tạo nên áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn. Hiện tượng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm lo lắng của toàn xã hội. Vi khuẩn kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết các kháng sinh dùng trong lâm sàng. Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn này còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác.
Mười bachủng vi khuẩn Salmonella phân lập được kiểm tra mức độ mẫn cảm với 10 loại kháng sinh và hóa dược thông dụng, kết quả kiểm tra và đánh giá theo phương pháp của Kirby-Bauer (1996). Kết quả được thể hiện ở biểu đồ hình 4.9.
Hình 4.9. Tần số kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân
Kết quả biểu đồ hình 4.9 cho thấy: Các chủng Salmonella được lựa chọn kháng hoàn toàn với cephalothin (chiếm tỷ lệ 100%), kháng cao với một số kháng sinh như: streptomycine (chiếm tỷ lệ 84,6%), tetracycline (chiếm tỷ lệ 61,5%), tiếp theo là kháng amoxicillin (53,8%), trimethoprime/sulfamethoxazol (53,8%), ampicillin (53,8%), chloramphenicol (46,2%).
Bên cạnh những kháng sinh đã bị kháng với tỷ lệ cao, các chủng vi khuẩn
Salmonella được thử vẫn rất mẫn cảm với gentamycin và ceftazidine (với tỷ lệ
100%), tiếp sau là ciprofloxacin (84,6%).
Với tỷ lệ ô nhiễm ở thân thịt cao, các Salmonella kháng kháng sinh trở thành nguồn lan truyền đặc tính kháng thuốc ra môi trường và đến người tiêu dùng theo chuỗi phân phối thịt lợn, thịt gia cầm. So sánh với một số nghiên cứu trước đây cho thấy kết quả kháng kháng sinh cao hơn với nghiên cứu này. Theo Thai and Yamaguchi (2012) tỷ lệ kháng tetracycline (54,5 %), streptomycin (41,5 %), chloramphenicol (35,6 %), và ampicillin (33,1 %). Trong khi nghiên cứu của Nguyễn Viết Không và cs. (2012) cho thấy tỷ lệ kháng thuốc của Salmonella
spp. đối với các nhóm kháng sinh khác đang ngày càng tăng, đặc biệt là những kháng sinh mới thuộc nhóm quinolones (A. nalidic, ciprofloxacin), trimethoprim/ sulfamethoxazole: trimethoprim (80%), nalidixic axit (62,22%),ciprofloxacin (35,56%). Điều này cho thấy việc lạm dụng kháng sinh quá nhiều, kể cả những loại kháng sinh thế hệ mới trong chăn nuôi.
Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng này. Bên cạnh việc sử dụng tràn lan nhiều loại kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi, việc lạm dụng kháng sinh để phòng và chữa bệnh cho động vật cũng đáng báo động. Điều này gây ra không ít khó khăn cho ngành thú y và cả nhân y vì yếu tố kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella luôn thay đổi theo thời gian, không gian khác nhau ở từng cá thểbởi các gen nằm trong plasmid (resistance).Ở các nước phát triển, hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella từ động vật sang người chủ yếu do việc sử dụng kháng sinh bừa bãi trong thức ăn chăn nuôi (Threlfall, 2002).
Vì vậy, trong từng thời gian nhất định, cần phải làm kháng sinh đồ để xác định chính xác khả năng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, ngoài mục đích lựa chọn kháng sinh mẫn cảm trong điều trị, còn để kiểm tra khả năng gây bệnh và độc lực của chủng vi khuẩn phân lập.
Ngày nay, vi khuẩn không chỉ kháng một loại thuốc kháng sinh mà có thể kháng lại nhiều loại thuốc kháng sinh cùng một lúc, khiến cho việc điều trị trở
nên khó khăn hơn. Mức độ kháng của 13 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được với 10 loại kháng sinh thông dụng được thể hiện ở bảng 4.4 và bảng 4.5.
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm với một số loại kháng
sinh của các chủng vi khuẩn Salmonellaspp. phân lập được
TT Mẫu Kết quả kháng/KS KS kiểm tra Sm Am Bt CF C Ax Ge Te Ci Cz 1 G1 R R S R S R S S I S 4/10 2 G2 R I S R S R S R S S 4/10 3 G3 R I S R R R S S S S 4/10 4 G4 R S R R S S S R I S 4/10 5 G5 I R R R S S S R S S 4/10 6 G6 R R S R S R S R S S 5/10 7 G7 R S R R R S S R S S 5/10 8 L1 R R S R R R S S S S 5/10 9 L2 I I S R S S S S S S 1/10 10 L3 R R R R R S S S S S 5/10 11 L4 R R R R S R S R S S 6/10 12 L5 R R R R R R S R S S 7/10 13 L7 R I R R R S S R S S 5/10
R: Kháng; I: Trung gian; S: Nhạy cảm
Sm: Streptomycine, Am: Ampicillin, Bt: Trimethoprime/Sulfamethoxazol; CF: Cephalothin, C: Chloramphenicol, Ax: Amoxicillin, G: Gentamycin, Te: Tetracycline, Ci: Ciprofloxacin, Cz: Ceftazidine.
Bảng 4.5. Mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập được Mức độ
kháng KS Số chủng kiểm tra Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Ký hiệu
Kháng 1 loại 13 1 7,69 L2 Kháng 4 loại 5 38,46 G1, G2, G3, G4, G5 Kháng 5 loại 5 38,46 G6, G7, L1, L3, L7 Kháng 6 loại 1 7,69 L4 Kháng 7 loại 1 7,69 L5
Kết quả bảng 4.4 cho thấy: trong số 13 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được kiểm tra mức độ mẫn cảm với kháng sinh, ngoại trừ chủng L2 đều có khả năng đa kháng kháng sinh với 4 – 7 loại kháng sinh. Và theo kết quả bảng 4.5, đa số các chủng kháng 4 -5 loại kháng sinh (chiếm tỷ lệ 38, 46%), kháng 6-7 loại kháng sinh chiếm tỷ lệ 7,69%.
Kết quả về tính đa kháng kháng sinh của nghiên cứu này tương đồng với những nghiên cứu trước đây. Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được 437 chủng Salmonella từ thịt bò, lợn, gà tươi sống. Các chủng này đã được xác định kháng kháng sinh. Trong đó có ít nhất 61 chủng Salmonella đa kháng, kháng ít nhất 5 loại kháng sinh thường dùng trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn gram âm gây ra và kháng ít nhất 2 kháng sinh cephalosporin phổ rộng như cefoxitin (Diệu Linh, 2012).
Như vậy, với tình trạng sử dụng kháng sinh không được kiểm soát tốt, sự xuất hiện của vi khuẩn đa kháng và kháng hoàn toàn các kháng sinh đang sử dụng hiện nay là hoàn toàn có thể xảy ra. Trong những năm gần đây, xét nghiệm vi khuẩn Salmonella phân lập được từ Hoa Kỳ và các nước khác đã chỉ ra rằng tỷ lệ ngày gia tăng các chủng đa kháng (Chen et al., 2004).
Do đó, chúng ta cần những biện pháp hạn chế sự kháng thuốc của vi khuẩn. Ủy ban tư vấn về an toàn vi sinh trong thực phẩm vương quốc Anh (ACMSF) khuyến cáo rằng một chính phủ sắp xếp chiến lược hướng tới việc giảm bớt việc sử dụng kháng sinh trong thú y, bao gồm cả việc công bố các quy định đối với những kháng sinh đặc biệt, và đưa ra một báo cáo tổng hợp hàng năm tóm tắt về sự kháng thuốc trong chuỗi thực phẩm phải được đưa ra bởi các tổ chức giám sát kháng thuốc kháng sinh ở người và thực phẩm có nguồn gốc động vật. Cuối cùng, báo cáo khuyến nghị tập trung nâng cao giáo dục đào tạo về vi khuẩn kháng kháng sinh trong thú y, nâng cao giám sát sức đề kháng và nghiên cứu nhiều hơn nữa (Threlfall, 1999).
Hiện nay, tetracyclin (tetracyclin, oxytetracyclin, doxycyclin, chlotetracyclin) là một trong những nhóm kháng sinh chủ yếu dùng trong thú y. Kháng sinh này cũng được dùng rộng rãi để chữa bệnh cho người. Các nhà nghiên cứu cho rằng nếu xuất hiện các loại vi khuẩn kháng tetracyclin, thì loại kháng sinh này sẽ không còn tác dụng khi đem điều trị các bệnh ở người. Chính vì lý do này mà ở Mỹ, tetracyclin đã bị cấm dùng trong thức ăn gia súc (Phạm Thị Giang, 2006). Còn chloramphenicol là kháng sinh đã cấm sử dụng từ lâu.
Trong số 10 loại kháng sinh lựa chọn để kiểm tra mức độ mẫn cảm với kháng sinh của 13 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được, kết quả kháng chloramphenicol và tetracycline được thể hiện ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Kết quả kháng chloramphenicol và tetracycline của chủng
vi khuẩn Salmonella phân lập được
Mức độ kháng KS Số chủng kháng Kháng chloramphenicol Kháng tetracycline n % Ký hiệu n % Ký hiệu Kháng 1 loại 1 0 0 0 0 Kháng 4 loại 5 1 20 G3 3 60 G2, G4, G5 Kháng 5 loại 5 4 80 G7, L1, L3, L7 3 60 G6, G7, L7 Kháng 6 loại 1 0 0 1 100 L4 Kháng 7 loại 1 1 100 L5 1 100 L5
Kết quả bảng 4.6 cho thấy: 2 chủng Salmonella đa kháng G7 và L5 trong đó kháng cả chloramphenicol và tetracycline phù hợp với hướng nghiên cứu chúng tôi quan tâm. Theo Nguyễn Thượng Chánh (2004), vi khuẩn Salmonella
đã đề kháng cùng một lúc với thuốc ampicilline, chloramphenicol, streptomycine và tetracycline. Chủng G1 và L2 không kháng chloramphenicol và tetracycline nên được chọn làm đối chứng trong các thí nghiệm tiếp theo.
4.3. KẾT QUẢ ĐỊNH TYP CHỦNG VI KHUẨN SALMONELLAĐA
KHÁNG PHÂN LẬP ĐƯỢC
Để góp phần phòng chống các vụ ngộ độc thực phẩm do Salmonella spp. gây ra có hiệu quả, việc xác định được tác nhân gây bệnh và hiểu đầy đủ bản chất của mầm bệnh có ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, việc xác định serovar của các chủng Salmonella spp. phân lập được ở các mẫu thịt tươi được bày bán ở một số chợ là một phần không thể thiếu trong nghiên cứu này. Kết quả giám định giúp chúng ta hiểu được serovar Salmonella spp. nào là tác nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm.
Lựa chọn 2 chủng vi khuẩn Salmonella đa kháng phân lập được, trong đó kháng lại nhóm kháng sinh chloramphenicol và tetracycline, chúng tôi đã tiến hành xác định serovar bằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm, sử dụng kháng huyết thanh O và H chuẩn (của hãng Denka Seiken Co.,
Ltd. Tokyo, Nhật Bản), sau đó đối chiếu theo bảng phân loại của Kauffmann and White Popoff (2001).
Theo Quinn et al. (2004), để xác định seroar của vi khuẩn Salmonella spp. nên lấy khuẩn lạc phát triển ở phần nghiêng của thạch TSI hoặc từ môi trường thạch thường. Trước hết, kiểm tra với kháng nguyên nhóm O, sau đó là kháng huyết thanh nhóm H.
Kết quả định typ kháng huyết thanh của chủng Salmonella G7 và L5 đa kháng sinh là hai chủng phù hợp với yêu cầu nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Kết quả xác định serotype của 2 chủng vi khuẩn Salmonella
đa kháng sinh Chủng kiểm tra Công thức kháng nguyên Định typ Kháng nguyên O Kháng nguyên H Pha 1 Pha 2
G7 (nguồn gốc từ gà) 7 f,g - SalmonellaRissen L5 (nguồn gốc từ lợn) 3,10 e,h l, w SalmonellaMeleagridis
Sự có mặt của các thành phần kháng nguyên O và kháng nguyên H là căn cứ để xác định serotype của vi khuẩn Salmonella. Kết quả ở bảng 4.5 cho thấychủng G7 có nguồn gốc từ thịt gà được xác định là S. Rissen và chủng L5 có nguồn gốc từ thịt lợn được xác định làS. Meleagridis.
Các nhà nghiên cứu Nhật Bản và Việt Nam đã thực hiện nghiên cứu về sự lan tràn của các chủng Salmonella kháng kháng sinh trong thịt lợn và thịt gia cầm bán lẻ ở miền Bắc Việt Nam. Phát hiện thấy 118 vi khuẩn Salmonella phân lập từ 283 mẫu thịt bán lẻ (135 mẫu thịt lợn và 148 mẫu thịt gà) mua tại thị trường bán lẻ ở miền Bắc Việt Nam. 13 serovar của khuẩn Salmonella bao gồm: Infantis, Anatum, Rissen, Reading, Emek, Typhimurium, Blockley, London, Newport, Derby, Weltevreden, Albany và Hadar đã được xác định (N.B., 2012).
Theo Thanh Hà (2014) trong số trên 2500 typ huyết thanh đã được phân lập, S. enterica serovar Enteritidis (viết tắt là S. Enteritidis) và S. enterica serovar Typhimurium(viết tắt là S. Typhimurium) là hai typ huyết thanh thông thường nhất gây ngộ độc thực phẩm cho người.
Kết quả xác định typ kháng huyết thanh trong nghiên cứu này tuy không phải typ chính gây ngộ độc thực phẩm nhưng cũng phần nào gây tác hại nếu thức ăn đó không được vệ sinh sạch sẽ hay nấu chín trước khi ăn.
Các nhà nghiên cứu đã thông báo về sự gia tăng cả về số ca nhiễm
Salmonella bởi chủng Salmonella Rissen ở Thái Lan và phân lập các serovar này
từ các sản phẩm thịt ở Thái Lan (Hendriksen et al., 2008).Salmonella enterica
serovar Rissen (S. Rissen) đã được công nhận là một trong những serovar phổ biến nhất giữa con người và hệ thống sản xuất thịt lợn ở những vùng khác nhau trên thế giới, đặc biệt là châu Á. Tại Hoa Kỳ, serovar này gây ra sự bùng phát nhưng ý nghĩa dịch tễ học của nó vẫn còn chưa được biết (Pornsukarom et al., 2015).
Khi nghiên cứu chủng Salmonella không gây bệnh thương hàn từ các trường hợp lâm sàng của con người, trẻ em không có triệu chứng và thịt tươi bán lẻ tại Yucatan, Mexico, Salmonella Typhimurium là serotype phổ biến nhất được tìm thấy ở người mắc bệnh (chiếm 21,8%), tiếp theo là Salmonella Agona (chiếm 21%).
Salmonella Enteritidis là một serotype nhỏ (chiếm 4,2%). Trẻ em không có triệu
chứng đã mang S. Agona (12,1%), S.Meleagridis (11,6%), S.Anatum (8%) và S.
Enteritidis (5,8%) (Zaidi et al., 2006).
4.4. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN VÀ ĐÁNH GIÁGEN KHÁNG THUỐC CỦA
CHỦNG SALMONELLA ĐA KHÁNG PHÂN LẬP ĐƯỢC
4.4.1.Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng Salmonella đa kháng phân
lập được
4.4.1.1. Tách chiết RNA tổng số
Phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi enzym Rnase. Rnase có hoạt tính cao, bền nhiệt, lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong nước bọt, trong không khí...) Dó đó, thao tác tách chiết RNA tốt nhất là ở điều kiện vô trùng, tránh tiếp xúc bằng tay trần.
Lựa chọn 2 chủng vi khuẩn Salmonella đa kháng G7, L5 trong đó kháng chloramphenicol và tetracycline và 2 chủng đối chứng L2 (đơn kháng), G1 (nhạy cảm với chloramphenicol và tetracycline) để tiến hành tách chiết RNA.
Kết quả trên hình cho thấy trên đường chạy có 2 băng điện di sắc nét, tương ứng với hai băng 28S và 18S của rRNA ribosome. Sự xuất hiện của các băng này chứng tỏ RNA không bị phân cắt và mẫu đủ tiêu chuẩn cho thí nghiệm.
Hình 4.10. Kết quả kiểm tra RNA 6 chủng Salmonella L5, G7, L2(1), L2(2), G1(1), G1(2)
4.4.1.2. Đo nồng độ các mẫu RNA tổng số
Bảng 4.8. Nồng độ RNA của chủng Salmonella sau khi tách chiết
Mẫu ng/µL A260/280 L5 1374,1 2,29 G7 2336,7 2,29 L2(1) 2749,3 1,90 L2(2) 1239,2 2,52 G1(1) 1147,4 2,06 G1(2) 903,8 2,49
Mọi nghiên cứu và ứng dụng của sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc chiết xuất và tinh sạch một lượng đủ lớn RNA. Yêu cầu của chiết xuất và tinh sạch là:
- Có được đủ một lượng axit nucleic mong muốn, còn nguyên vẹn.
- Không bị phân huỷ, bị gãy bởi tác động cơ giới, hoặc bị phân giải bởi một số enzyme nội, ngoại bào và hoá chất.
- Không hoặc ít lẫn tạp protein, RNA và một số đại phân tử khác như lipid, gluxit và các xác tế bào khác.
Nồng độ RNA tổng số tách được có giá trị từ 800 ng/µl trở lên và độ tinh sạch đạt yêu cầu với tỷ lệ đo được ở bước sóng 260/280 nm luôn nằm trong khoảng 1,8-2,2. Với độ tinh sạch, và nồng độ này, các mẫu RNA đã đạt yêu cầu để sử dụng để tổng hợp cDNA. Từ bảng 4.8 trên có thể thấy nồng độRNA tổng sốcủa 4 mẫu L5, G7, L2(1), G1(1) là phù hợp yêu cầu.
4.4.2. Kết quả RT-PCR phát hiện gen kháng kháng sinh của chủng
Salmonella đa kháng
2chủng Salmonella G1, G7 (nguồn gốc thịt gà) và 2 chủng L2, L5 (nguồngốc thịt lợn) sau khi tách chiết RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp cDNA làm khuôn mẫu cho phản ứng RT-PCR sử dụng các cặp mồi cho gen mã hóa kháng tetracyclines (tet), chloramphenicol (cml), chloramphenicol acetyltransferase (cat), phenicol (floR) và gen đối chứng 16S rRNA.
Kết quả RT – PCR cho thấy, chủng Salmonella đa kháng G7 và L5 đều không mang gen tetB mã hóa kháng tetracycline (hình 4.11).
Hình 4.11. Kết quả RT – PCR phát hiện sự có mặt của gen tetB mã hóa
kháng tetracycline của chủng Salmonella đa kháng
M: thang chuẩn (DNA 1Kb)
1: G1, 2: G7, 3: L2, 4: L5, 5: đối chứng âm
Tiến hành thí nghiệm RT-PCR với chủng Salmonella đa kháng G7 (nguồn gốc thịt gà, sử dụng các cặp mồi tương ứng với các gen tetC, tetD, tetE, tetG mã hóa kháng tetracyclines, cat-2, cmlA, cmlB mã hóa kháng chloramphenicol,
floRmã hóa kháng phenicol.
Kết quả hình 4.12 cho thấy: sản phẩm PCR ở giếng số 8 có một băng DNA có kích thướctương đương với kích thước lý thuyết của gen floR (1212 bp).
Hình 4.12. Kết quả RT - PCR phát hiện gen floR mã hóa kháng phenicol
của chủng Salmonella đa kháng nguồn gốc từ gà G7
M: thang chuẩn (DNA 1Kb)
1 – 8: cặp mồi theo từng gen (1 -tetC, 2-tetD, 3-tetE, 4-tetG, 5-cat2, 6-
cmlA, 7-cmlB, 8-floR)
Tiếp tục thí nghiệm RT-PCR sử dụng các cặp mồi tương ứng các gen tetB,
tetC, tetD, tetE, tetG mã hóa kháng tetracyclines, cat-2,cmlA,cmlB mã hóa kháng